Come contare cellule e nuclei nelle immagini di microscopia

Modi per contare cellule e nuclei

In un campo affollato, un modello di deep learning separa i nuclei a contatto molto meglio di una soglia. Controlla la licenza di qualsiasi modello preaddestrato che usi: alcuni sono solo per uso non commerciale.

Come contare i nuclei in ImageJ (Fiji)

1. Apri l’immagine in Fiji (CZI, ND2 e la maggior parte dei formati da microscopio si aprono tramite Bio-Formats). Controlla la scala in Image › Properties, così le dimensioni risultano in µm.
2. Tieni solo il canale nucleare (ad esempio DAPI): Image › Color › Split Channels, oppure Image › Type › 8-bit per un’immagine a canale singolo.
3. Applica una leggera sfocatura con Process › Filters › Gaussian Blur (sigma 1-2) per ridurre il rumore.
4. Applica una soglia con Image › Adjust › Threshold (prova Otsu o Default), poi Apply per creare una maschera binaria.
5. Separa i nuclei a contatto con Process › Binary › Watershed.
6. Esegui Analyze › Analyze Particles con un intervallo di dimensioni che escluda i detriti, spunta Summarize e Display results. La finestra Summary mostra il conteggio; la tabella Results elenca l’area di ogni oggetto.

Per molte immagini, registra questi passaggi con Plugins › Macros › Record ed esegui la macro su una cartella. Per le cellule positive, misura l’intensità di ogni nucleo nel canale del marcatore e imposta una soglia.

Come contare nuclei e cellule in SlideScope (senza codice)

1. Apri l’immagine in SlideScope su Windows o Mac e scegli il campo, il piano o la regione da contare. I piani di grandi dimensioni vengono analizzati a risoluzione ridotta, quindi in un vetrino da gigapixel conta una regione.
2. Scegli nuclei, cellule o particelle e il motore: i pesi di deep learning InstanSeg per nuclei e cellule, oppure una soglia classica con selezione automatica di Otsu, smoothing e limiti di area.
3. Controlla la sovrapposizione ed escludi qualsiasi oggetto che la segmentazione ha individuato in modo errato.
4. Esporta una tabella degli oggetti in CSV, contorni GeoJSON (si aprono in QuPath), una maschera TIFF etichettata e un riepilogo dei metodi, oppure salva le impostazioni come ricetta ed eseguila sul primo piano di ogni immagine di una cartella.

I risultati comprendono conteggi, densità per mm² ovunque sia registrata la dimensione del pixel, area e forma di ogni oggetto, intensità media in ogni canale e, facoltativamente, la classificazione come positivo al marcatore rispetto a uno o due canali di marcatore. La segmentazione viene eseguita sul tuo computer; nulla viene caricato. Maggiori dettagli nella pagina sul conteggio.

Quale scegliere

Per poche immagini di fluorescenza pulite, Fiji è gratuito e i passaggi qui sopra richiedono pochi minuti. Per vetrini interi o per la valutazione delle cellule positive in IHC, QuPath è la scelta gratuita di riferimento. Per migliaia di immagini in una pipeline fissa, CellProfiler. Scegli SlideScope quando vuoi contare, misurare e visualizzare in un’unica app desktop senza configurazione né script, per CZI, ND2, SVS, LIF e altri formati, con le immagini che restano sul tuo computer. Per un elenco più ampio, consulta il confronto dei software di analisi di immagini di microscopia.

Domande sulla conta cellulare

Fonti

• Documentazione di ImageJ — Analyze Particles
• Documentazione di ImageJ — Watershed
• Documentazione di QuPath — Detecting cells
• CellProfiler
• Cellpose e StarDist
• InstanSeg