Conta cellulare
Calcolatore per emocitometro
Inserisci ciò che hai contato nella camera e ottieni la concentrazione cellulare, la vitalità, il numero totale di cellule e la quantità di sospensione da prelevare. Funziona con i reticoli Neubauer migliorata, Bürker e Fuchs-Rosenthal, con qualsiasi quadrato contato e con qualsiasi diluizione, compresa la consueta miscela 1:1 con blu tripano.
Come funziona la formula dell’emocitometro
Ogni quadrato del reticolo di conta contiene un volume noto: la sua area moltiplicata per la profondità della camera. In una camera di Neubauer migliorata un quadrato grande misura 1 mm × 1 mm e la camera è profonda 0,1 mm, quindi un quadrato grande contiene 0,1 mm³, cioè 0,1 µL o 10⁻⁴ mL. Dividendo il conteggio medio per quadrato per quel volume si ottengono le cellule per mL; moltiplicando per la diluizione si annulla l’effetto del colorante o del tampone aggiunto.
cellule/mL = (N ÷ quadrati) ÷ (area mm² × profondità mm) × 1000 × diluizione
Esempio svolto: 200 cellule vive nei 4 quadrati d’angolo, miscelate 1:1 con blu tripano. 200 ÷ 4 = 50 cellule per quadrato; 50 × 10⁴ × 2 = 1,0 × 10⁶ cellule vive/mL. Con anche 10 cellule morte, la vitalità è 200 ÷ 210 = 95,2 %. Per seminare 500.000 cellule, preleva 500.000 ÷ 1.000.000 = 0,5 mL.
Regole di conta che mantengono il numero affidabile
- Regola dei bordi: conta le cellule che toccano le linee superiore e sinistra di un quadrato e salta quelle che toccano le linee inferiore e destra, così nessuna cellula viene contata due volte.
- Conta abbastanza cellule: l’errore di conteggio è poissoniano, circa 1/√N. 100 cellule danno circa ±10 %, 400 cellule circa ±5 %. Conta più quadrati, o entrambe le camere, quando la densità è bassa.
- Diluisci i campioni troppo densi: se un quadrato grande contiene più di circa 100 cellule, le cellule si sovrappongono e alcune sfuggono. Diluisci, riconta e inserisci il nuovo fattore di diluizione.
- Blu tripano: una miscela 1:1 con blu tripano allo 0,4 % corrisponde a un fattore di diluizione di 2. Conta entro pochi minuti, perché le cellule vive iniziano ad assorbire il colorante e la vitalità cala quanto più a lungo restano a contatto.
- Mescola prima di caricare: le cellule sedimentano nella provetta in pochi secondi; pipetta su e giù, poi riempi la camera con un unico movimento fluido senza riempirla troppo.
Quale quadrato hai contato?
| Camera e quadrato | Area | Profondità | Volume per quadrato | Fattore (× conteggio per quadrato) |
|---|---|---|---|---|
| Neubauer migliorata o Bürker, quadrato grande | 1 mm² | 0.1 mm | 0,1 µL | 10⁴ |
| Neubauer migliorata, uno dei 25 quadrati centrali | 0,04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Neubauer migliorata, quadrato più piccolo | 0,0025 mm² | 0.1 mm | 0,25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal, quadrato da 1 mm | 1 mm² | 0.2 mm | 0,2 µL | 5 × 10³ |
Il fattore si riferisce alle cellule contate per quadrato, prima della diluizione. I vetrini da conta monouso di solito riproducono il reticolo Neubauer migliorata con profondità di 0,1 mm; in caso di dubbio controlla il foglietto illustrativo del vetrino.
Contare invece le cellule nelle immagini
Un emocitometro conta le cellule in sospensione. Per contare nuclei o cellule in una micrografia o in un vetrino intero, usa l’analisi d’immagine: Analyze Particles di Fiji, QuPath, CellProfiler oppure SlideScope, che conta nuclei e cellule sul tuo computer senza codice e riporta la densità per mm² in base alla calibrazione dell’immagine. Leggi come contare le cellule nelle immagini di microscopia.
Domande
Come si calcolano le cellule per mL con un emocitometro?
Calcola la media del conteggio per quadrato, dividila per il volume di un quadrato (area × profondità; per un quadrato grande della Neubauer 1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 10⁻⁴ mL) e moltiplica per il fattore di diluizione. Per i quadrati grandi della Neubauer si ottiene media per quadrato × 10⁴ × diluizione.
Qual è il fattore di diluizione con il blu tripano?
Miscelare volumi uguali di sospensione cellulare e blu tripano (ad esempio 10 µL + 10 µL) dimezza la concentrazione, quindi il fattore di diluizione è 2. Una miscela di 1 parte di cellule e 4 parti di colorante corrisponde a un fattore di 5.
Come si calcola la vitalità cellulare?
Vitalità (%) = cellule vive ÷ (cellule vive + morte) × 100. Con il blu tripano le cellule vive restano chiare e quelle morte si colorano di blu.
Quanti quadrati devo contare?
Conta abbastanza quadrati da arrivare ad almeno 100 cellule, idealmente da 200 a 400; l’errore è circa 1/√N. Per la maggior parte delle colture bastano i quattro quadrati grandi d’angolo; i campioni poco densi richiedono tutti e nove o entrambe le camere.
Perché moltiplicare per 10.000?
Un quadrato grande di una camera di Neubauer contiene 0,1 µL (1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 0,1 mm³). In 1 mL ci sono 10.000 di questi volumi, quindi cellule per quadrato × 10.000 = cellule per mL.
Questo calcolatore è gratuito?
Sì. Funziona nel tuo browser e non invia nulla da nessuna parte. SlideScope, l’app desktop per microscopia creata dallo stesso team, è un’app a pagamento con una libreria di campioni gratuita (tutti gli strumenti) e un abbonamento per le tue immagini.
Fonti
I risultati sono teorici o aritmetici; confrontali con la documentazione del tuo strumento prima di farvi affidamento per attività cliniche o regolamentate.
Misura sulle tue immagini reali
SlideScope apre 34 formati di microscopi e scanner per vetrini, tra cui CZI, ND2, SVS e LIF, con la loro calibrazione, così lunghezze, aree, conteggi di cellule e barre di scala risultano in µm senza dover impostare nulla. Prova gratis tutti gli strumenti sui campioni inclusi; per aprire le tue immagini serve un abbonamento. Hai già deciso? Abbonati ora.