Kalibrierung
Pixelgrößenrechner für Mikroskope (µm pro Pixel)
Ermitteln Sie, wie viele Mikrometer ein Pixel in Ihrem Bild abdeckt. Auf drei Wegen: aus Kamera und Objektiv, aus einer gemessenen Strecke wie einem Objektmikrometer oder für eine Ebene der Bildpyramide eines Whole-Slide-Bildes. Diese Zahl sorgt dafür, dass Maßstabsbalken, Längen- und Flächenmessungen stimmen.
So wird die Pixelgröße in der Probenebene berechnet
Pixelgröße (µm/px) = Kamerapixel (µm) × Binning ÷ (Objektiv × Kameraadapter)
Das Pixel der Kamera selbst (zum Beispiel 6,5 µm bei vielen sCMOS-Kameras, 3,45 µm bei gängigen CMOS-Sensoren) wird über das Objektiv und einen etwaigen Kameraadapter auf das Präparat projiziert. Binning 2 × 2 fasst vier Pixel zu einem zusammen und verdoppelt damit die Pixelgröße. Das Okular des Mikroskops spielt keine Rolle.
Rechenbeispiel: 6,5-µm-Pixel, 60×-Objektiv, 1×-Adapter, kein Binning: 6,5 ÷ 60 = 0,108 µm pro Pixel bzw. 9,2 Pixel pro µm. Vergleichen Sie das mit der Nyquist-Pixelgröße für Ihr Objektiv, um zu sehen, ob die Kamera die Optik ausreichend abtastet.
Kalibrieren mit einem Objektmikrometer
Die Formel setzt voraus, dass die nominellen Vergrößerungen exakt sind; meist liegen sie innerhalb weniger Prozent. Für Messungen, die Sie veröffentlichen, kalibrieren Sie jedes Objektiv einmal: Nehmen Sie ein Objektmikrometer auf (einen Objektträger mit eingravierter Skala, oft 1 mm in 100 Teilstrichen zu 10 µm), ziehen Sie eine Linie über so viele Teilstriche wie möglich und teilen Sie die tatsächliche Länge durch die Länge der Linie in Pixeln.
Rechenbeispiel: 100 µm des Mikrometers entsprechen 400 Pixeln: 100 ÷ 400 = 0,25 µm pro Pixel. In Fiji erledigt Analyze › Set Scale dasselbe; in SlideScope speichert View › Set Pixel Size… den Wert für dieses Bild, wenn die Datei keinen enthält.
Mikrometer pro Pixel (MPP) in Whole-Slide-Bildern
Slide-Scanner speichern die Pixelgröße der Basisebene in der Datei (Aperio SVS schreibt „MPP“, andere Formate ein entsprechendes Tag). Üblicherweise entspricht ein 40×-Scan etwa 0,25 µm pro Pixel und ein 20×-Scan etwa 0,5 µm pro Pixel; der genaue Wert hängt vom Scanner ab (das OpenSlide-Testpräparat CMU-1, ein Aperio-Scan bei 20×, speichert 0,499 µm/px). Jede Pyramidenebene multipliziert die MPP mit ihrem Downsample-Faktor, sodass Ebene 2 eines 40×-Präparats mit Downsample 16 bei 4 µm pro Pixel liegt, was etwa 2,5× entspricht.
In Python lesen Sie den Wert mit openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] aus (siehe SVS-Dateien in Python lesen). Desktop-Viewer, darunter SlideScope, lesen ihn automatisch und zeichnen danach den Maßstabsbalken.
Fragen
Wie berechnet man Mikrometer pro Pixel?
Teilen Sie die Pixelgröße der Kamera durch die Gesamtvergrößerung zwischen Präparat und Kamera (Objektiv × Kameraadapter) und multiplizieren Sie mit dem Binning. Oder nehmen Sie ein Objektmikrometer auf und teilen Sie eine bekannte Länge durch ihre Länge in Pixeln.
Was bedeutet MPP in der Pathologie?
Mikrometer pro Pixel (Microns per Pixel): die Breite eines Pixels in der Probenebene eines Whole-Slide-Bildes. Etwa 0,25 µm/px wird üblicherweise als 40× bezeichnet, 0,5 µm/px als 20×.
Warum zeigt mein Bild den falschen Maßstabsbalken?
Der Datei fehlt die Pixelgröße, oder sie enthält eine falsche (manche TIFF-Exporte speichern 1 Pixel pro Zoll). Legen Sie die Pixelgröße durch Kalibrierung fest; in Fiji mit Analyze › Set Scale, in SlideScope mit View › Set Pixel Size….
Ändert das Okular die Pixelgröße?
Nein. Die Kamera sieht das vom Objektiv (und Adapter) erzeugte Bild, nicht das Bild durch das Okular.
Ist dieser Rechner kostenlos?
Ja. Er läuft in Ihrem Browser und sendet nichts irgendwohin. SlideScope, die Desktop-App für Mikroskopie vom selben Team, ist eine kostenpflichtige App mit kostenloser Beispielbibliothek (alle Werkzeuge) und einem Abonnement für Ihre eigenen Bilder.
Quellen
Die Ergebnisse sind theoretisch bzw. rein rechnerisch; gleichen Sie sie mit der Dokumentation Ihres Geräts ab, bevor Sie sich bei klinischen oder regulierten Arbeiten darauf verlassen.
Messen Sie an Ihren echten Bildern
SlideScope öffnet 34 Formate von Mikroskopen und Slide-Scannern, darunter CZI, ND2, SVS und LIF, mit ihrer eigenen Kalibrierung, sodass Längen, Flächen, Zellzahlen und Maßstabsbalken ohne jede Einrichtung in µm ausgegeben werden. Testen Sie alle Werkzeuge kostenlos an den mitgelieferten Beispielen; zum Öffnen Ihrer eigenen Bilder benötigen Sie ein Abonnement. Schon entschieden? Jetzt abonnieren.