Калибровка
Калькулятор размера пикселя микроскопа (µm на пиксель)
Узнайте, сколько микрометров приходится на один пиксель вашего изображения. Три способа: по камере и объективу, по измеренному расстоянию, например на объект-микрометре, или для уровня пирамиды полнослайдового изображения. Именно это число делает правильными масштабную линейку и измерения длины или площади.
Как рассчитывается размер пикселя в плоскости образца
размер пикселя (µm/px) = пиксель камеры (µm) × биннинг ÷ (объектив × адаптер камеры)
Собственный пиксель камеры (например, 6,5 µm у многих sCMOS-камер, 3,45 µm у распространённых CMOS-сенсоров) проецируется на препарат через объектив и адаптер камеры, если он есть. Биннинг 2 × 2 объединяет четыре пикселя в один, удваивая размер пикселя. Окуляр микроскопа роли не играет.
Пример расчёта: пиксели 6,5 µm, объектив 60×, адаптер 1×, без биннинга: 6,5 ÷ 60 = 0,108 µm на пиксель, или 9,2 пикселя на µm. Сравните это с размером пикселя по Найквисту для вашего объектива, чтобы понять, достаточно ли камера дискретизирует оптику.
Калибровка по объект-микрометру
Формула предполагает, что номинальные увеличения точны; обычно они верны с точностью до нескольких процентов. Для измерений, которые вы будете публиковать, откалибруйте каждый объектив один раз: снимите объект-микрометр (стекло с нанесённой шкалой, часто 1 мм, разделённый на 100 делений по 10 µm), проведите линию вдоль как можно большего числа делений и разделите реальную длину на длину линии в пикселях.
Пример расчёта: 100 µm объект-микрометра занимают 400 пикселей: 100 ÷ 400 = 0,25 µm на пиксель. В Fiji то же самое делает Analyze › Set Scale; в SlideScope команда View › Set Pixel Size… сохраняет значение для этого изображения, если в файле его нет.
Микрометры на пиксель (MPP) в полнослайдовых изображениях
Сканеры слайдов записывают размер пикселя базового уровня в файл (Aperio SVS записывает «MPP», другие форматы — эквивалентный тег). По соглашению скан 40× — это около 0,25 µm на пиксель, а скан 20× — около 0,5 µm на пиксель; точное значение зависит от сканера (тестовый слайд OpenSlide CMU-1, скан Aperio при 20×, записывает 0,499 µm/px). Каждый уровень пирамиды умножает MPP на свой коэффициент уменьшения, поэтому уровень 2 слайда 40× с коэффициентом 16 — это 4 µm на пиксель, что эквивалентно примерно 2,5×.
Прочитать его в Python можно так: openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] (см. чтение файлов SVS в Python). Настольные просмотрщики, включая SlideScope, читают его автоматически и строят по нему масштабную линейку.
Вопросы
Как рассчитать микрометры на пиксель?
Разделите размер пикселя камеры на общее увеличение между препаратом и камерой (объектив × адаптер камеры) и умножьте на биннинг. Или снимите объект-микрометр и разделите известную длину на её длину в пикселях.
Что такое MPP в патологии?
Микрометры на пиксель (microns per pixel): ширина одного пикселя в плоскости препарата в полнослайдовом изображении. По соглашению около 0,25 µm/px называют 40×, а 0,5 µm/px — 20×.
Почему на изображении неправильная масштабная линейка?
В файле нет размера пикселя или записан неверный (некоторые экспорты TIFF сохраняют 1 пиксель на дюйм). Задайте размер пикселя калибровкой: в Fiji через Analyze › Set Scale, в SlideScope через View › Set Pixel Size….
Меняет ли окуляр размер пикселя?
Нет. Камера видит изображение, сформированное объективом (и адаптером), а не через окуляр.
Этот калькулятор бесплатный?
Да. Он работает в вашем браузере и никуда ничего не отправляет. SlideScope — настольное приложение для микроскопии от той же команды — платное, с бесплатной библиотекой образцов (все инструменты) и подпиской для ваших собственных изображений.
Источники
Результаты носят теоретический или арифметический характер; прежде чем полагаться на них в клинической или регулируемой работе, сверьте их с документацией вашего прибора.
Измеряйте на своих реальных изображениях
SlideScope открывает 34 формата микроскопов и сканеров слайдов, в том числе CZI, ND2, SVS и LIF, с их собственной калибровкой, поэтому длины, площади, подсчёт клеток и масштабные линейки получаются в µm без какой-либо настройки. Попробуйте все инструменты бесплатно на встроенных образцах; чтобы открывать собственные изображения, нужна подписка. Уже решили? Оформите подписку.