Kalibratie
Pixelgroottecalculator voor de microscoop (µm per pixel)
Bereken hoeveel micrometer één pixel in je beeld beslaat. Op drie manieren: uit de camera en het objectief, uit een gemeten afstand zoals een objectmicrometer, of voor een niveau van de piramide van een whole-slide-beeld. Dat getal zorgt ervoor dat een schaalbalk, een lengte- of een oppervlaktemeting klopt.
Zo wordt de pixelgrootte op het preparaat berekend
pixelgrootte (µm/px) = camerapixel (µm) × binning ÷ (objectief × camera-adapter)
De eigen pixel van de camera (bijvoorbeeld 6,5 µm bij veel sCMOS-camera's, 3,45 µm bij gangbare CMOS-sensoren) wordt via het objectief en een eventuele camera-adapter op het preparaat geprojecteerd. Binning 2 × 2 voegt vier pixels samen tot één, waardoor de pixelgrootte verdubbelt. Het oculair van de microscoop speelt geen rol.
Rekenvoorbeeld: pixels van 6,5 µm, 60×-objectief, 1×-adapter, geen binning: 6,5 ÷ 60 = 0,108 µm per pixel, oftewel 9,2 pixels per µm. Vergelijk dat met de Nyquist-pixelgrootte voor je objectief om te zien of de camera de optiek goed bemonstert.
Kalibreren met een objectmicrometer
De formule gaat ervan uit dat de nominale vergrotingen exact zijn; meestal wijken ze een paar procent af. Kalibreer voor metingen die je gaat publiceren elk objectief één keer: maak een opname van een objectmicrometer (een objectglaasje met een schaalverdeling, vaak 1 mm in 100 delen van 10 µm), trek een lijn langs zoveel delen als in beeld passen en deel de werkelijke lengte door de lengte van de lijn in pixels.
Rekenvoorbeeld: 100 µm van de micrometer beslaat 400 pixels: 100 ÷ 400 = 0,25 µm per pixel. In Fiji doet Analyze › Set Scale hetzelfde; in SlideScope slaat View › Set Pixel Size… de waarde voor dat beeld op als het bestand er zelf geen bevat.
Micron per pixel (MPP) in whole-slide-beelden
Slidescanners leggen de pixelgrootte van het basisniveau vast in het bestand (Aperio SVS schrijft "MPP", andere formaten een vergelijkbare tag). Volgens afspraak is een 40×-scan ongeveer 0,25 µm per pixel en een 20×-scan ongeveer 0,5 µm per pixel; de exacte waarde hangt af van de scanner (de OpenSlide-testcoupe CMU-1, een Aperio-scan op 20×, vermeldt 0,499 µm/px). Elk piramideniveau vermenigvuldigt de MPP met zijn downsample, dus niveau 2 van een 40×-coupe met downsample 16 is 4 µm per pixel, wat overeenkomt met ongeveer 2,5×.
Lees de waarde in Python uit met openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] (zie SVS-bestanden inlezen in Python). Desktopviewers, waaronder SlideScope, lezen hem automatisch en tekenen er de schaalbalk mee.
Vragen
Hoe bereken je micron per pixel?
Deel de pixelgrootte van de camera door de totale vergroting tussen preparaat en camera (objectief × camera-adapter) en vermenigvuldig met de binning. Of maak een opname van een objectmicrometer en deel een bekende lengte door de lengte ervan in pixels.
Wat is MPP in de pathologie?
Micron per pixel: de breedte van één pixel op het preparaat in een whole-slide-beeld. Ongeveer 0,25 µm/px heet volgens afspraak 40× en 0,5 µm/px 20×.
Waarom toont mijn beeld de verkeerde schaalbalk?
Het bestand mist de pixelgrootte of bevat een verkeerde waarde (sommige TIFF-exports slaan 1 pixel per inch op). Stel de pixelgrootte in door te kalibreren; in Fiji met Analyze › Set Scale, in SlideScope met View › Set Pixel Size….
Verandert het oculair de pixelgrootte?
Nee. De camera ziet het beeld dat het objectief (en de adapter) vormt, niet door het oculair heen.
Is deze calculator gratis?
Ja. Hij draait in je browser en stuurt nergens iets naartoe. SlideScope, de desktopapp voor microscopie van hetzelfde team, is een betaalde app met een gratis voorbeeldbibliotheek (elke tool) en een abonnement voor je eigen beelden.
Bronnen
De resultaten zijn theoretisch of rekenkundig; controleer ze aan de hand van de documentatie van je instrument voordat je erop vertrouwt voor klinisch of gereguleerd werk.
Meet op je echte beelden
SlideScope opent 34 formaten van microscopen en slidescanners, waaronder CZI, ND2, SVS en LIF, met hun eigen kalibratie, zodat lengtes, oppervlakken, celtellingen en schaalbalken in µm uitkomen zonder dat je iets hoeft in te stellen. Probeer elke tool gratis op de ingebouwde voorbeelden; voor het openen van je eigen beelden heb je een abonnement nodig. Al besloten? Nu abonneren.