Calibrazione
Calcolatore della dimensione del pixel al microscopio (µm per pixel)
Scopri quanti micrometri copre un pixel nella tua immagine. Tre modi: a partire da fotocamera e obiettivo, da una distanza misurata come quella di un micrometro oggetto, oppure per un livello della piramide di un’immagine whole slide. È questo numero a rendere corretta una barra di scala, una lunghezza o una misura di area.
Come si calcola la dimensione del pixel sul campione
dimensione del pixel (µm/px) = pixel della fotocamera (µm) × binning ÷ (obiettivo × adattatore della fotocamera)
Il pixel della fotocamera (per esempio 6,5 µm in molte fotocamere sCMOS, 3,45 µm nei comuni sensori CMOS) viene proiettato sul campione attraverso l’obiettivo e l’eventuale adattatore della fotocamera. Il binning 2 × 2 unisce quattro pixel in uno, raddoppiando la dimensione del pixel. L’oculare del microscopio non ha alcun ruolo.
Esempio svolto: pixel da 6,5 µm, obiettivo 60×, adattatore 1×, nessun binning: 6,5 ÷ 60 = 0,108 µm per pixel, cioè 9,2 pixel per µm. Confronta questo valore con la dimensione del pixel di Nyquist per il tuo obiettivo per capire se la fotocamera campiona correttamente l’ottica.
Calibrare con un micrometro oggetto
La formula presuppone che gli ingrandimenti nominali siano esatti; di solito lo sono entro pochi punti percentuali. Per le misure che pubblicherai, calibra una volta ogni obiettivo: acquisisci l’immagine di un micrometro oggetto (un vetrino con una scala graduata, spesso 1 mm suddiviso in 100 divisioni da 10 µm), traccia una linea lungo quante più divisioni possibile e dividi la lunghezza reale per la lunghezza della linea in pixel.
Esempio svolto: 100 µm del micrometro occupano 400 pixel: 100 ÷ 400 = 0,25 µm per pixel. In Fiji, Analyze › Set Scale fa la stessa cosa; in SlideScope, View › Set Pixel Size… lo memorizza per quell’immagine quando il file non ne contiene uno.
Micron per pixel (MPP) nelle immagini whole slide
Gli scanner per vetrini registrano nel file la dimensione del pixel del livello base (Aperio SVS scrive "MPP", altri formati un tag equivalente). Per convenzione una scansione a 40× corrisponde a circa 0,25 µm per pixel e una a 20× a circa 0,5 µm per pixel; il valore esatto dipende dallo scanner (il vetrino di prova CMU-1 di OpenSlide, una scansione Aperio a 20×, riporta 0,499 µm/px). Ogni livello della piramide moltiplica l’MPP per il suo fattore di sottocampionamento, quindi il livello 2 di un vetrino a 40× con sottocampionamento 16 è di 4 µm per pixel, equivalente a circa 2,5×.
Leggilo in Python con openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] (vedi leggere file SVS in Python). I visualizzatori desktop, SlideScope compreso, lo leggono automaticamente e lo usano per disegnare la barra di scala.
Domande
Come si calcolano i micron per pixel?
Dividi la dimensione del pixel della fotocamera per l’ingrandimento totale tra campione e fotocamera (obiettivo × adattatore della fotocamera) e moltiplica per il binning. Oppure acquisisci l’immagine di un micrometro oggetto e dividi una lunghezza nota per la sua lunghezza in pixel.
Che cos’è l’MPP in patologia?
Micron per pixel: la larghezza di un pixel sul campione in un’immagine whole slide. Per convenzione, circa 0,25 µm/px si chiama 40× e 0,5 µm/px 20×.
Perché la mia immagine mostra una barra di scala sbagliata?
Il file non contiene la dimensione del pixel oppure ne riporta una errata (alcune esportazioni TIFF salvano 1 pixel per pollice). Imposta la dimensione del pixel tramite calibrazione: in Fiji usa Analyze › Set Scale, in SlideScope View › Set Pixel Size….
L’oculare cambia la dimensione del pixel?
No. La fotocamera vede l’immagine formata dall’obiettivo (e dall’adattatore), non attraverso l’oculare.
Questo calcolatore è gratuito?
Sì. Funziona nel tuo browser e non invia nulla da nessuna parte. SlideScope, l’app desktop per microscopia creata dallo stesso team, è un’app a pagamento con una libreria di campioni gratuita (tutti gli strumenti) e un abbonamento per le tue immagini.
Fonti
I risultati sono teorici o aritmetici; confrontali con la documentazione del tuo strumento prima di farvi affidamento per attività cliniche o regolamentate.
Misura sulle tue immagini reali
SlideScope apre 34 formati di microscopi e scanner per vetrini, tra cui CZI, ND2, SVS e LIF, con la loro calibrazione, così lunghezze, aree, conteggi di cellule e barre di scala risultano in µm senza dover impostare nulla. Prova gratis tutti gli strumenti sui campioni inclusi; per aprire le tue immagini serve un abbonamento. Hai già deciso? Abbonati ora.