Calibração
Calculadora do tamanho de píxel do microscópio (µm por píxel)
Descubra quantos micrómetros um píxel cobre na sua imagem. Três formas: a partir da câmara e da objetiva, a partir de uma distância medida, como um micrómetro de platina, ou para um nível da pirâmide de uma imagem de lâmina inteira. É esse número que torna corretas uma barra de escala ou uma medição de comprimento ou de área.
Como se calcula o tamanho de píxel na amostra
tamanho de píxel (µm/px) = píxel da câmara (µm) × binning ÷ (objetiva × adaptador da câmara)
O píxel da própria câmara (por exemplo, 6,5 µm em muitas câmaras sCMOS e 3,45 µm em sensores CMOS comuns) é projetado sobre a amostra através da objetiva e de qualquer adaptador da câmara. O binning 2 × 2 junta quatro píxeis num só, duplicando o tamanho de píxel. A ocular do microscópio não tem qualquer papel.
Exemplo prático: píxeis de 6,5 µm, objetiva de 60×, adaptador de 1×, sem binning: 6,5 ÷ 60 = 0,108 µm por píxel, ou 9,2 píxeis por µm. Compare esse valor com o tamanho de píxel de Nyquist da sua objetiva para ver se a câmara amostra corretamente a ótica.
Calibrar com um micrómetro de platina
A fórmula pressupõe que as ampliações nominais são exatas; normalmente estão dentro de uma margem de alguns por cento. Para medições que vai publicar, calibre cada objetiva uma vez: obtenha uma imagem de um micrómetro de platina (uma lâmina com uma escala graduada, muitas vezes 1 mm em 100 divisões de 10 µm), trace uma linha ao longo do maior número possível de divisões e divida o comprimento real pelo comprimento da linha em píxeis.
Exemplo prático: 100 µm do micrómetro abrangem 400 píxeis: 100 ÷ 400 = 0,25 µm por píxel. No Fiji, Analyze › Set Scale faz o mesmo; no SlideScope, View › Set Pixel Size… guarda o valor para essa imagem quando o ficheiro não o contém.
Micrómetros por píxel (MPP) em imagens de lâmina inteira
Os digitalizadores de lâminas registam no ficheiro o tamanho de píxel do nível base (o Aperio SVS escreve "MPP", outros formatos uma etiqueta equivalente). Por convenção, uma digitalização a 40× tem cerca de 0,25 µm por píxel e uma digitalização a 20× cerca de 0,5 µm por píxel; o valor exato depende do digitalizador (a lâmina de teste CMU-1 do OpenSlide, uma digitalização Aperio a 20×, regista 0,499 µm/px). Cada nível da pirâmide multiplica o MPP pelo seu fator de redução, por isso o nível 2 de uma lâmina a 40× com fator de redução 16 tem 4 µm por píxel, o que equivale a cerca de 2,5×.
Leia-o em Python com openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] (consulte ler ficheiros SVS em Python). Os visualizadores para computador, incluindo o SlideScope, leem-no automaticamente e desenham a barra de escala a partir dele.
Perguntas
Como se calculam os micrómetros por píxel?
Divida o tamanho de píxel da câmara pela ampliação total entre a amostra e a câmara (objetiva × adaptador da câmara) e multiplique pelo binning. Ou obtenha uma imagem de um micrómetro de platina e divida um comprimento conhecido pelo seu comprimento em píxeis.
O que é o MPP em patologia?
Micrómetros por píxel (microns per pixel): a largura de um píxel na amostra numa imagem de lâmina inteira. Por convenção, cerca de 0,25 µm/px chama-se 40× e 0,5 µm/px chama-se 20×.
Porque é que a minha imagem mostra a barra de escala errada?
O ficheiro não tem o tamanho de píxel ou tem um valor errado (algumas exportações TIFF guardam 1 píxel por polegada). Defina o tamanho de píxel por calibração; no Fiji use Analyze › Set Scale, no SlideScope View › Set Pixel Size….
A ocular altera o tamanho de píxel?
Não. A câmara vê a imagem formada pela objetiva (e pelo adaptador), não através da ocular.
Esta calculadora é gratuita?
Sim. Funciona no seu navegador e não envia nada para lado nenhum. O SlideScope, a aplicação de microscopia para computador da mesma equipa, é uma aplicação paga com uma biblioteca de amostras gratuita (todas as ferramentas) e uma subscrição para as suas próprias imagens.
Fontes
Os resultados são teóricos ou aritméticos; confronte-os com a documentação do seu instrumento antes de confiar neles para trabalho clínico ou regulamentado.
Meça nas suas imagens reais
O SlideScope abre 34 formatos de microscópios e digitalizadores de lâminas, entre eles CZI, ND2, SVS e LIF, com a respetiva calibração, pelo que comprimentos, áreas, contagens de células e barras de escala saem em µm sem configurar nada. Experimente gratuitamente todas as ferramentas nas amostras incluídas; para abrir as suas próprias imagens precisa de uma subscrição. Já decidiu? Subscreva agora.