Optik
Rechner für Mikroskopauflösung und numerische Apertur
Geben Sie die Wellenlänge und die numerische Apertur des Objektivs ein und sehen Sie, wie feine Details es trennen kann, lateral und entlang der optischen Achse, für Weitfeld- und Konfokalmikroskopie, und wie klein Ihre Pixel sein müssen, um diese Details zu erfassen (Nyquist). Weiter unten: numerische Apertur aus dem Öffnungswinkel sowie Schärfentiefe.
Auflösungsformeln und wann sie jeweils gelten
| Grenze | Formel | Verwenden für |
|---|---|---|
| Abbe | d = Wellenlänge ÷ (2 × NA) | Das feinste periodische Detail, das das Objektiv überträgt |
| Rayleigh | r = 0,61 × Wellenlänge ÷ NA | Zwei Punktquellen, Objektiv und Kondensor angepasst (oder Fluoreszenz) |
| Hellfeld mit Kondensor | r = 1,22 × Wellenlänge ÷ (NAobj + NAcond) | Durchlicht, wenn die NA des Kondensors kleiner ist als die des Objektivs |
| Axial, Weitfeld | z ≈ 2 × Wellenlänge × n ÷ NA² | Wie dünn die Schicht ist, die ein Weitfeldbild trennt |
| Konfokal, kleine Lochblende | 0,37 × Wellenlänge ÷ NA lateral; 0,64 × Wellenlänge ÷ (n − √(n² − NA²)) axial | FWHM mit einer Lochblende unter 0,25 Airy-Einheiten (Zeiss) |
Wellenlänge bedeutet bei der Weitfeld-Fluoreszenz die Emissionswellenlänge und bei der Konfokalmikroskopie einen Mittelwert aus Anregungs- und Emissionswellenlänge; NA ist die numerische Apertur des Objektivs und n der Brechungsindex des Immersionsmediums. Die Vergrößerung kommt nirgends vor: Sie bestimmt, wie groß ein Detail erscheint, nicht, ob es aufgelöst wird. Dies sind theoretische Bestwerte; ein falsch justierter Kondensor, geringer Kontrast, dicke Proben und Brechungsindex-Fehlanpassung verschlechtern die tatsächliche Auflösung.
Rechenbeispiel: 520 nm Emission und ein Ölimmersionsobjektiv mit NA 1,4: Rayleigh 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2,8 = 186 nm; axial etwa 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 nm.
Nyquist-Abtastung: wie klein Ihre Pixel sein müssen
Um Details aufzuzeichnen, die die Optik auflöst, darf die Pixelgröße in der Probenebene höchstens halb so groß sein wie die kleinste aufgelöste Periode. Die Nyquist-Referenz von SVI gibt den kritischen Abtastabstand mit Emissionswellenlänge ÷ (4 × NA) für Weitfeld und Anregungswellenlänge ÷ (8 × NA) für Konfokal an; viele Core Facilities teilen die Auflösung einfach durch 2,3, um eine Sicherheitsmarge zu haben. Größere Pixel verlieren Details unwiederbringlich (Unterabtastung); deutlich kleinere kosten nur Licht, Zeit und Speicherplatz, es sei denn, Sie planen eine Dekonvolution.
Prüfen Sie Ihre tatsächliche Pixelgröße mit dem Pixelgrößenrechner: Ein 6,5-µm-Kamerapixel hinter einem 60×-Objektiv entspricht 108 nm in der Probenebene und tastet 520-nm-Licht bei NA 1,4 (Nyquist 93 nm) etwas zu grob ab.
Numerische Apertur
NA = n × sin(halber Öffnungswinkel)
Der halbe Öffnungswinkel ist die Hälfte des Öffnungswinkels des Lichtkegels, den das Objektiv aufnimmt, und n ist der Brechungsindex zwischen Deckglas und Frontlinse. In Luft kann die NA 1 nicht erreichen; reale Trockenobjektive enden bei etwa 0,95. Wasserimmersion erreicht etwa 1,27, Silikonöl etwa 1,35 und Ölimmersion etwa 1,4 bis 1,49. Die NA eines Objektivs ist nach seiner Vergrößerung eingraviert, zum Beispiel „60×/1.40 Oil“.
Schärfentiefe (MicroscopyU): d = Wellenlänge × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), wobei e der kleinste Abstand ist, den der Detektor auflöst (etwa ein Kamerapixel), und M die Vergrößerung des Objektivs. Objektive mit hoher NA haben eine sehr geringe Schärfentiefe; deshalb braucht ein dicker Schnitt einen Z-Stapel.
Fragen
Wie hoch ist die Auflösung eines Lichtmikroskops?
Etwa 200–250 nm lateral mit einem Ölimmersionsobjektiv hoher NA im sichtbaren Licht (0,61 × 520 nm ÷ 1,4 ≈ 227 nm nach dem Rayleigh-Kriterium) und rund 500–800 nm entlang der optischen Achse.
Was ist der Unterschied zwischen der Abbe- und der Rayleigh-Grenze?
Abbe (Wellenlänge ÷ 2NA) ist die feinste periodische Struktur, die ein Objektiv überträgt; Rayleigh (0,61 × Wellenlänge ÷ NA) ist der Abstand, bei dem sich zwei Punktquellen gerade noch unterscheiden lassen. Beide skalieren mit Wellenlänge ÷ NA; Rayleigh ist der konservativere Wert.
Wie berechnet man die numerische Apertur?
NA = n × sin(halber Öffnungswinkel), wobei n der Brechungsindex des Immersionsmediums ist und der halbe Öffnungswinkel die Hälfte des Öffnungswinkels des Lichtkegels. Ein Trockenobjektiv mit einem halben Öffnungswinkel von 64° hat NA = sin 64° ≈ 0,90.
Welche Pixelgröße brauche ich für die Nyquist-Abtastung?
Höchstens Wellenlänge ÷ (4 × NA) in der Probenebene bei Weitfeld (Emissionswellenlänge), Wellenlänge ÷ (8 × NA) bei Konfokal (Anregungswellenlänge). Für 520 nm und NA 1,4 sind das etwa 93 nm (Weitfeld) bzw. 46 nm (konfokal).
Ergibt eine höhere Vergrößerung eine bessere Auflösung?
Nein. Die Auflösung wird durch NA und Wellenlänge bestimmt. Eine höhere Vergrößerung ohne höhere NA vergrößert nur dieselbe Unschärfe ("leere Vergrößerung").
Ist dieser Rechner kostenlos?
Ja. Er läuft in Ihrem Browser und sendet nichts irgendwohin. SlideScope, die Desktop-App für Mikroskopie vom selben Team, ist eine kostenpflichtige App mit kostenloser Beispielbibliothek (alle Werkzeuge) und einem Abonnement für Ihre eigenen Bilder.
Quellen
- Nikon MicroscopyU — Resolution
- Nikon MicroscopyU — Depth of field and depth of focus
- ZEISS — Basics of confocal laser scanning microscopy (Wilhelm)
- SVI Huygens — The Nyquist rate
Die Ergebnisse sind theoretisch bzw. rein rechnerisch; gleichen Sie sie mit der Dokumentation Ihres Geräts ab, bevor Sie sich bei klinischen oder regulierten Arbeiten darauf verlassen.
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