Calibración
Calculadora del tamaño de píxel del microscopio (µm por píxel)
Calcula cuántos micrómetros abarca un píxel de tu imagen. De tres formas: a partir de la cámara y el objetivo, a partir de una distancia medida, como un micrómetro de platina, o para un nivel de la pirámide de una imagen de portaobjetos completo. Ese número es lo que hace que una barra de escala o una medición de longitud o de área sean correctas.
Cómo se calcula el tamaño de píxel en la muestra
tamaño de píxel (µm/px) = píxel de la cámara (µm) × binning ÷ (objetivo × adaptador de cámara)
El píxel propio de la cámara (por ejemplo, 6,5 µm en muchas cámaras sCMOS o 3,45 µm en sensores CMOS habituales) se proyecta sobre la muestra a través del objetivo y de cualquier adaptador de cámara. El binning 2 × 2 fusiona cuatro píxeles en uno y duplica el tamaño de píxel. El ocular del microscopio no interviene.
Ejemplo práctico: píxeles de 6,5 µm, objetivo de 60×, adaptador de 1×, sin binning: 6,5 ÷ 60 = 0,108 µm por píxel, o 9,2 píxeles por µm. Compáralo con el tamaño de píxel de Nyquist de tu objetivo para ver si la cámara muestrea correctamente la óptica.
Calibración con un micrómetro de platina
La fórmula supone que los aumentos nominales son exactos; normalmente lo son con un margen de unos pocos puntos porcentuales. Para mediciones que vayas a publicar, calibra cada objetivo una vez: toma una imagen de un micrómetro de platina (un portaobjetos con una escala grabada, a menudo 1 mm en 100 divisiones de 10 µm), traza una línea a lo largo de tantas divisiones como quepan y divide la longitud real entre la longitud de la línea en píxeles.
Ejemplo práctico: 100 µm del micrómetro abarcan 400 píxeles: 100 ÷ 400 = 0,25 µm por píxel. En Fiji, Analyze › Set Scale hace lo mismo; en SlideScope, View › Set Pixel Size… lo guarda para esa imagen cuando el archivo no lo incluye.
Micras por píxel (MPP) en imágenes de portaobjetos completos
Los escáneres de portaobjetos registran en el archivo el tamaño de píxel del nivel base (Aperio SVS escribe "MPP"; otros formatos, una etiqueta equivalente). Por convención, un escaneo a 40× tiene unos 0,25 µm por píxel y uno a 20×, unos 0,5 µm por píxel; el valor exacto depende del escáner (el portaobjetos de prueba CMU-1 de OpenSlide, un escaneo de Aperio a 20×, registra 0,499 µm/px). Cada nivel de la pirámide multiplica el MPP por su factor de submuestreo, así que el nivel 2 de un portaobjetos a 40× con submuestreo 16 tiene 4 µm por píxel, lo que equivale a unos 2,5×.
Léelo en Python con openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] (consulta cómo leer archivos SVS en Python). Los visores de escritorio, incluido SlideScope, lo leen automáticamente y dibujan la barra de escala a partir de él.
Preguntas
¿Cómo se calculan las micras por píxel?
Divide el tamaño de píxel de la cámara entre el aumento total entre la muestra y la cámara (objetivo × adaptador de cámara) y multiplica por el binning. O toma una imagen de un micrómetro de platina y divide una longitud conocida entre su longitud en píxeles.
¿Qué es el MPP en patología?
Micras por píxel: el ancho de un píxel en la muestra en una imagen de portaobjetos completo. Por convención, unos 0,25 µm/px se denominan 40× y 0,5 µm/px, 20×.
¿Por qué mi imagen muestra una barra de escala incorrecta?
Al archivo le falta el tamaño de píxel o lleva uno incorrecto (algunas exportaciones TIFF guardan 1 píxel por pulgada). Fija el tamaño de píxel mediante calibración; en Fiji usa Analyze › Set Scale, y en SlideScope, View › Set Pixel Size….
¿El ocular cambia el tamaño de píxel?
No. La cámara ve la imagen formada por el objetivo (y el adaptador), no a través del ocular.
¿Esta calculadora es gratuita?
Sí. Funciona en tu navegador y no envía nada a ninguna parte. SlideScope, la aplicación de microscopía de escritorio creada por el mismo equipo, es una aplicación de pago con una biblioteca de muestras gratuita (todas las herramientas) y una suscripción para tus propias imágenes.
Fuentes
Los resultados son teóricos o aritméticos; compruébalos con la documentación de tu instrumento antes de basarte en ellos para trabajo clínico o regulado.
Mide en tus imágenes reales
SlideScope abre 34 formatos de microscopio y de escáner de portaobjetos, entre ellos CZI, ND2, SVS y LIF, con su propia calibración, así que las longitudes, áreas, recuentos de células y barras de escala salen en µm sin configurar nada. Prueba gratis todas las herramientas con las muestras integradas; para abrir tus propias imágenes necesitas una suscripción. ¿Ya lo tienes claro? Suscríbete ahora.