Calibração
Calculadora de tamanho de pixel do microscópio (µm por pixel)
Descubra quantos micrômetros um pixel cobre na sua imagem. Há três maneiras: a partir da câmera e da objetiva, a partir de uma distância medida, como um micrômetro de platina, ou para um nível da pirâmide de uma imagem de lâmina inteira. É esse número que torna corretas uma barra de escala, uma medição de comprimento ou de área.
Como o tamanho do pixel na amostra é calculado
tamanho do pixel (µm/px) = pixel da câmera (µm) × binning ÷ (objetiva × adaptador da câmera)
O pixel da própria câmera (por exemplo, 6,5 µm em muitas câmeras sCMOS e 3,45 µm em sensores CMOS comuns) é projetado sobre a amostra pela objetiva e por qualquer adaptador da câmera. O binning 2 × 2 junta quatro pixels em um, dobrando o tamanho do pixel. A ocular do microscópio não tem nenhum papel nisso.
Exemplo resolvido: pixels de 6,5 µm, objetiva de 60×, adaptador de 1×, sem binning: 6,5 ÷ 60 = 0,108 µm por pixel, ou 9,2 pixels por µm. Compare com o tamanho de pixel de Nyquist da sua objetiva para ver se a câmera amostra a óptica adequadamente.
Calibração com um micrômetro de platina
A fórmula supõe que as ampliações nominais são exatas; normalmente elas ficam dentro de alguns por cento. Para medições que você vai publicar, calibre cada objetiva uma vez: fotografe um micrômetro de platina (uma lâmina com uma escala graduada, muitas vezes 1 mm em 100 divisões de 10 µm), trace uma linha ao longo do maior número de divisões que couber e divida o comprimento real pelo comprimento da linha em pixels.
Exemplo resolvido: 100 µm do micrômetro ocupam 400 pixels: 100 ÷ 400 = 0,25 µm por pixel. No Fiji, Analyze › Set Scale faz o mesmo; no SlideScope, View › Set Pixel Size… grava esse valor para a imagem quando o arquivo não traz um.
Mícrons por pixel (MPP) em imagens de lâminas inteiras
Os scanners de lâminas registram no arquivo o tamanho do pixel do nível base (o Aperio SVS grava "MPP"; outros formatos, uma tag equivalente). Por convenção, uma digitalização em 40× tem cerca de 0,25 µm por pixel e uma em 20×, cerca de 0,5 µm por pixel; o valor exato depende do scanner (a lâmina de teste CMU-1 do OpenSlide, uma digitalização Aperio em 20×, registra 0,499 µm/px). Cada nível da pirâmide multiplica o MPP pelo seu fator de redução, então o nível 2 de uma lâmina de 40× com fator de redução 16 tem 4 µm por pixel, o equivalente a cerca de 2,5×.
Leia esse valor em Python com openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] (veja como ler arquivos SVS em Python). Visualizadores para desktop, incluindo o SlideScope, o leem automaticamente e desenham a barra de escala a partir dele.
Perguntas
Como calcular mícrons por pixel?
Divida o tamanho do pixel da câmera pela ampliação total entre a amostra e a câmera (objetiva × adaptador da câmera) e multiplique pelo binning. Ou fotografe um micrômetro de platina e divida um comprimento conhecido pelo seu comprimento em pixels.
O que é MPP em patologia?
Mícrons por pixel: a largura de um pixel na amostra em uma imagem de lâmina inteira. Por convenção, cerca de 0,25 µm/px é chamado de 40× e 0,5 µm/px de 20×.
Por que minha imagem mostra a barra de escala errada?
O arquivo não tem o tamanho do pixel ou traz um valor errado (algumas exportações TIFF gravam 1 pixel por polegada). Defina o tamanho do pixel por calibração; no Fiji, use Analyze › Set Scale; no SlideScope, View › Set Pixel Size….
A ocular altera o tamanho do pixel?
Não. A câmera vê a imagem formada pela objetiva (e pelo adaptador), não através da ocular.
Esta calculadora é gratuita?
Sim. Ela roda no seu navegador e não envia nada a lugar nenhum. O SlideScope, o aplicativo de microscopia para desktop feito pela mesma equipe, é um aplicativo pago com uma biblioteca de amostras gratuita (todas as ferramentas) e uma assinatura para suas próprias imagens.
Fontes
Os resultados são teóricos ou aritméticos; confira-os com a documentação do seu instrumento antes de usá-los em trabalhos clínicos ou regulamentados.
Meça nas suas imagens reais
O SlideScope abre 34 formatos de microscópios e scanners de lâminas, entre eles CZI, ND2, SVS e LIF, com a calibração de cada arquivo, então comprimentos, áreas, contagens de células e barras de escala saem em µm sem nenhuma configuração. Experimente todas as ferramentas de graça com as amostras incluídas; para abrir suas próprias imagens, é preciso uma assinatura. Já decidiu? Assine agora.