Kalibrace
Kalkulačka velikosti pixelu pro mikroskop (µm na pixel)
Zjistěte, kolik mikrometrů ve vašem snímku pokrývá jeden pixel. Třemi způsoby: z kamery a objektivu, ze změřené vzdálenosti, například na objektovém mikrometru, nebo pro úroveň pyramidy celoplošného snímku. Právě toto číslo zajišťuje, že měřítko, délka i měření plochy jsou správné.
Jak se počítá velikost pixelu ve vzorku
velikost pixelu (µm/px) = pixel kamery (µm) × binning ÷ (objektiv × adaptér kamery)
Vlastní pixel kamery (například 6.5 µm u mnoha kamer sCMOS, 3.45 µm u běžných čipů CMOS) se promítá na preparát přes objektiv a případný adaptér kamery. Binning 2 × 2 sloučí čtyři pixely do jednoho, a velikost pixelu se tak zdvojnásobí. Okulár mikroskopu nehraje žádnou roli.
Řešený příklad: pixely 6.5 µm, objektiv 60×, adaptér 1×, bez binningu: 6.5 ÷ 60 = 0.108 µm na pixel, neboli 9.2 pixelu na µm. Porovnejte to s velikostí pixelu podle Nyquista pro váš objektiv a zjistíte, zda kamera vzorkuje optiku dostatečně.
Kalibrace pomocí objektového mikrometru
Vzorec předpokládá, že nominální zvětšení jsou přesná; obvykle se od skutečnosti liší o několik procent. U měření, která budete publikovat, každý objektiv jednou zkalibrujte: nasnímejte objektový mikrometr (sklíčko s vyrytou stupnicí, často 1 mm rozdělený na 100 dílků po 10 µm), nakreslete čáru přes co nejvíce dílků, které se vejdou do obrazu, a skutečnou délku vydělte délkou čáry v pixelech.
Řešený příklad: 100 µm mikrometru odpovídá 400 pixelům: 100 ÷ 400 = 0.25 µm na pixel. Ve Fiji totéž udělá Analyze › Set Scale; ve SlideScope ji View › Set Pixel Size… uloží pro daný snímek, pokud ji soubor sám neobsahuje.
Mikrometry na pixel (MPP) v celoplošných snímcích
Skenery preparátů zapisují velikost pixelu základní úrovně do souboru (Aperio SVS zapisuje „MPP“, jiné formáty ekvivalentní tag). Podle konvence má sken 40× přibližně 0.25 µm na pixel a sken 20× přibližně 0.5 µm na pixel; přesná hodnota závisí na skeneru (testovací preparát OpenSlide CMU-1, sken Aperio při 20×, uvádí 0.499 µm/px). Každá úroveň pyramidy násobí MPP svým podvzorkováním, takže úroveň 2 preparátu 40× s podvzorkováním 16 má 4 µm na pixel, což odpovídá zhruba 2.5×.
V Pythonu ji načtete pomocí openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] (viz čtení souborů SVS v Pythonu). Desktopové prohlížeče včetně SlideScope ji načítají automaticky a podle ní kreslí měřítko.
Otázky
Jak vypočítat mikrometry na pixel?
Vydělte velikost pixelu kamery celkovým zvětšením mezi preparátem a kamerou (objektiv × adaptér kamery) a vynásobte binningem. Nebo nasnímejte objektový mikrometr a známou délku vydělte její délkou v pixelech.
Co je MPP v patologii?
Mikrometry na pixel (microns per pixel): šířka jednoho pixelu ve vzorku v celoplošném snímku. Přibližně 0.25 µm/px se podle konvence označuje jako 40× a 0.5 µm/px jako 20×.
Proč můj snímek ukazuje špatné měřítko?
Soubor nemá uloženou velikost pixelu nebo obsahuje chybnou (některé exporty TIFF ukládají 1 pixel na palec). Nastavte velikost pixelu kalibrací; ve Fiji přes Analyze › Set Scale, ve SlideScope přes View › Set Pixel Size….
Mění okulár velikost pixelu?
Ne. Kamera snímá obraz vytvořený objektivem (a adaptérem), ne obraz za okulárem.
Je tato kalkulačka zdarma?
Ano. Běží ve vašem prohlížeči a nikam nic neposílá. SlideScope, desktopová aplikace pro mikroskopii od stejného týmu, je placená aplikace s bezplatnou knihovnou ukázek (všechny nástroje) a předplatným pro vlastní snímky.
Zdroje
Výsledky jsou teoretické nebo aritmetické; než se na ně budete spoléhat při klinické nebo regulované práci, ověřte je podle dokumentace svého přístroje.
Měřte na svých skutečných snímcích
SlideScope otevře 34 formátů mikroskopů a skenerů preparátů, mimo jiné CZI, ND2, SVS a LIF, s jejich vlastní kalibrací, takže délky, plochy, počty buněk i měřítka vycházejí v µm bez jakéhokoli nastavování. Vyzkoušejte všechny nástroje zdarma na vestavěných ukázkách; pro otevírání vlastních snímků potřebujete předplatné. Už máte jasno? Předplaťte si ho.