Étalonnage
Calculateur de taille de pixel au microscope (µm par pixel)
Déterminez combien de micromètres couvre un pixel de votre image. Trois méthodes : à partir de la caméra et de l’objectif, à partir d’une distance mesurée, par exemple sur un micromètre objet, ou pour un niveau de la pyramide d’une image de lame entière. C’est cette valeur qui rend exacts une barre d’échelle, une mesure de longueur ou de surface.
Comment se calcule la taille de pixel dans l’échantillon
taille de pixel (µm/px) = pixel de la caméra (µm) × binning ÷ (objectif × adaptateur de caméra)
Le pixel propre de la caméra (par exemple 6,5 µm sur de nombreuses caméras sCMOS, 3,45 µm sur les capteurs CMOS courants) est projeté sur l’échantillon à travers l’objectif et l’éventuel adaptateur de caméra. Un binning 2 × 2 fusionne quatre pixels en un seul, ce qui double la taille de pixel. L’oculaire du microscope n’intervient pas.
Exemple détaillé : pixels de 6,5 µm, objectif 60×, adaptateur 1×, sans binning : 6,5 ÷ 60 = 0,108 µm par pixel, soit 9,2 pixels par µm. Comparez cette valeur avec la taille de pixel de Nyquist de votre objectif pour savoir si la caméra échantillonne correctement l’optique.
Étalonner avec un micromètre objet
La formule suppose que les grossissements nominaux sont exacts ; ils le sont généralement à quelques pour cent près. Pour des mesures destinées à être publiées, étalonnez chaque objectif une fois : imagez un micromètre objet (une lame portant une échelle graduée, souvent 1 mm divisé en 100 graduations de 10 µm), tracez une ligne le long d’autant de graduations que possible, puis divisez la longueur réelle par la longueur de la ligne en pixels.
Exemple détaillé : 100 µm du micromètre couvrent 400 pixels : 100 ÷ 400 = 0,25 µm par pixel. Dans Fiji, Analyze › Set Scale fait la même chose ; dans SlideScope, View › Set Pixel Size… l’enregistre pour cette image lorsque le fichier n’en contient pas.
Microns par pixel (MPP) dans les images de lames entières
Les scanners de lames enregistrent dans le fichier la taille de pixel du niveau de base (Aperio SVS écrit « MPP », les autres formats une balise équivalente). Par convention, une numérisation à 40× correspond à environ 0,25 µm par pixel et une numérisation à 20× à environ 0,5 µm par pixel ; la valeur exacte dépend du scanner (la lame de test OpenSlide CMU-1, une numérisation Aperio à 20×, indique 0,499 µm/px). Chaque niveau de la pyramide multiplie le MPP par son facteur de sous-échantillonnage : le niveau 2 d’une lame à 40× avec un sous-échantillonnage de 16 correspond donc à 4 µm par pixel, soit l’équivalent d’environ 2,5×.
Lisez-la en Python avec openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] (voir lire des fichiers SVS en Python). Les visionneuses de bureau, dont SlideScope, la lisent automatiquement et en tirent la barre d’échelle.
Questions
Comment calculer le nombre de microns par pixel ?
Divisez la taille de pixel de la caméra par le grossissement total entre l’échantillon et la caméra (objectif × adaptateur de caméra), puis multipliez par le binning. Ou bien imagez un micromètre objet et divisez une longueur connue par sa longueur en pixels.
Qu’est-ce que le MPP en pathologie ?
Microns par pixel : la largeur d’un pixel dans l’échantillon pour une image de lame entière. Par convention, environ 0,25 µm/px est appelé 40× et 0,5 µm/px 20×.
Pourquoi mon image affiche-t-elle une barre d’échelle erronée ?
Le fichier ne contient pas de taille de pixel, ou en contient une erronée (certains exports TIFF enregistrent 1 pixel par pouce). Définissez la taille de pixel par étalonnage : dans Fiji, avec Analyze › Set Scale ; dans SlideScope, avec View › Set Pixel Size….
L’oculaire modifie-t-il la taille de pixel ?
Non. La caméra voit l’image formée par l’objectif (et l’adaptateur), pas à travers l’oculaire.
Ce calculateur est-il gratuit ?
Oui. Il s’exécute dans votre navigateur et n’envoie rien nulle part. SlideScope, l’application de microscopie de bureau conçue par la même équipe, est une application payante avec une bibliothèque d’échantillons gratuite (tous les outils) et un abonnement pour vos propres images.
Sources
Les résultats sont théoriques ou arithmétiques ; vérifiez-les par rapport à la documentation de votre instrument avant de vous y fier pour un travail clinique ou réglementé.
Mesurez sur vos vraies images
SlideScope ouvre 34 formats de microscopes et de scanners de lames, dont CZI, ND2, SVS et LIF, avec leur propre étalonnage : longueurs, surfaces, comptages de cellules et barres d’échelle sont donnés en µm sans aucun réglage. Essayez gratuitement tous les outils sur les échantillons intégrés ; pour ouvrir vos propres images, il faut un abonnement. Déjà décidé ? Abonnez-vous maintenant.