כיול
מחשבון גודל פיקסל במיקרוסקופ (µm לפיקסל)
גלו כמה מיקרומטרים מכסה פיקסל אחד בתמונה שלכם. שלוש דרכים: מתוך המצלמה והעדשה האובייקטיבית, מתוך מרחק שנמדד, למשל בעזרת מיקרומטר שולחן, או עבור רמה בפירמידה של תמונת שקופית מלאה. המספר הזה הוא מה שהופך פס קנה מידה, מדידת אורך או מדידת שטח לנכונים.
איך מחשבים את גודל הפיקסל בדגימה
גודל פיקסל (µm/px) = פיקסל המצלמה (µm) × binning ÷ (עדשה אובייקטיבית × מתאם מצלמה)
הפיקסל של המצלמה עצמה (למשל 6.5 µm במצלמות sCMOS רבות, 3.45 µm בחיישני CMOS נפוצים) מוקרן על הדגימה דרך העדשה האובייקטיבית ודרך מתאם המצלמה, אם יש. Binning של 2 × 2 ממזג ארבעה פיקסלים לאחד, ומכפיל את גודל הפיקסל. לעינית של המיקרוסקופ אין שום תפקיד בחישוב.
דוגמה מחושבת: פיקסלים של 6.5 µm, עדשה אובייקטיבית של 60×, מתאם של 1×, בלי binning: 6.5 ÷ 60 = 0.108 µm לפיקסל, או 9.2 פיקסלים ל-µm. השוו את זה לגודל הפיקסל לפי Nyquist של העדשה האובייקטיבית שלכם כדי לראות אם המצלמה דוגמת את האופטיקה כראוי.
כיול בעזרת מיקרומטר שולחן
הנוסחה מניחה שההגדלות הנומינליות מדויקות; בדרך כלל הן מדויקות בטווח של אחוזים בודדים. למדידות שתפרסמו, כיילו כל עדשה אובייקטיבית פעם אחת: צלמו מיקרומטר שולחן (שקופית עם סקאלה חרוטה, לרוב 1 mm המחולק ל-100 שנתות של 10 µm), ציירו קו לאורך כמה שיותר שנתות שנכנסות לתמונה, וחלקו את האורך האמיתי באורך הקו בפיקסלים.
דוגמה מחושבת: 100 µm של המיקרומטר משתרעים על 400 פיקסלים: 100 ÷ 400 = 0.25 µm לפיקסל. ב-Fiji, Analyze › Set Scale עושה את אותו הדבר; ב-SlideScope, View › Set Pixel Size… שומר את הערך עבור התמונה הזו כשהקובץ לא כולל גודל פיקסל.
מיקרונים לפיקסל (MPP) בתמונות שקופית מלאה
סורקי שקופיות רושמים בקובץ את גודל הפיקסל ברמת הבסיס (Aperio SVS כותב "MPP", פורמטים אחרים תג מקביל). לפי המוסכמה, סריקה ב-40× היא בערך 0.25 µm לפיקסל וסריקה ב-20× בערך 0.5 µm לפיקסל; הערך המדויק תלוי בסורק (שקופית הבדיקה CMU-1 של OpenSlide, סריקת Aperio ב-20×, רושמת 0.499 µm/px). כל רמה בפירמידה מכפילה את ה-MPP ביחס ההקטנה שלה, כך שרמה 2 של שקופית שנסרקה ב-40× עם יחס הקטנה של 16 היא 4 µm לפיקסל, שקולה להגדלה של כ-2.5×.
קראו אותו ב-Python בעזרת openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] (ראו קריאת קובצי SVS ב-Python). מציגים למחשב, כולל SlideScope, קוראים אותו אוטומטית ומציירים לפיו את פס קנה המידה.
שאלות
איך מחשבים מיקרונים לפיקסל?
חלקו את גודל הפיקסל של המצלמה בהגדלה הכוללת שבין הדגימה למצלמה (עדשה אובייקטיבית × מתאם מצלמה), והכפילו ב-binning. לחלופין, צלמו מיקרומטר שולחן וחלקו אורך ידוע באורכו בפיקסלים.
מהו MPP בפתולוגיה?
מיקרונים לפיקסל (microns per pixel): הרוחב של פיקסל אחד בדגימה בתמונת שקופית מלאה. לפי המוסכמה, כ-0.25 µm/px נקרא 40× ו-0.5 µm/px נקרא 20×.
למה התמונה שלי מציגה פס קנה מידה שגוי?
בקובץ חסר גודל הפיקסל, או שנשמר בו ערך שגוי (חלק מקובצי ה-TIFF המיוצאים שומרים פיקסל אחד לאינץ'). קבעו את גודל הפיקסל בעזרת כיול; ב-Fiji השתמשו ב-Analyze › Set Scale, וב-SlideScope ב-View › Set Pixel Size….
האם העינית משנה את גודל הפיקסל?
לא. המצלמה רואה את התמונה שיוצרת העדשה האובייקטיבית (והמתאם), לא דרך העינית.
האם המחשבון הזה חינמי?
כן. הוא רץ בדפדפן שלכם ולא שולח דבר לשום מקום. SlideScope, אפליקציית המיקרוסקופיה למחשב של אותו צוות, היא אפליקציה בתשלום עם ספריית דוגמאות חינמית (כל הכלים) ומנוי לתמונות שלכם.
מקורות
התוצאות תיאורטיות או חשבוניות; בדקו אותן מול התיעוד של המכשיר שלכם לפני שתסתמכו עליהן בעבודה קלינית או מפוקחת.
מדדו על התמונות האמיתיות שלכם
SlideScope פותח 34 פורמטים של מיקרוסקופים וסורקי שקופיות, ביניהם CZI, ND2, SVS ו-LIF, עם הכיול שלהם, כך שאורכים, שטחים, ספירות תאים ופסי קנה מידה מתקבלים ב-µm בלי להגדיר דבר. נסו כל כלי בחינם על הדוגמאות המובנות; כדי לפתוח את התמונות שלכם נדרש מנוי. כבר החלטתם? הירשמו למנוי עכשיו.