การปรับเทียบ
เครื่องคำนวณขนาดพิกเซลของกล้องจุลทรรศน์ (µm ต่อพิกเซล)
หาว่าหนึ่งพิกเซลในภาพของคุณครอบคลุมกี่ไมโครเมตร ทำได้สามวิธี: จากกล้องถ่ายภาพและเลนส์ใกล้วัตถุ จากระยะที่วัดได้ เช่น stage micrometer หรือสำหรับระดับหนึ่งของพีระมิดภาพสไลด์ทั้งแผ่น ค่านี้คือสิ่งที่ทำให้แถบมาตราส่วน การวัดความยาว หรือการวัดพื้นที่ถูกต้อง
วิธีคำนวณขนาดพิกเซลที่ตัวอย่าง
ขนาดพิกเซล (µm/px) = พิกเซลของกล้อง (µm) × binning ÷ (เลนส์ใกล้วัตถุ × อะแดปเตอร์กล้อง)
พิกเซลของกล้องเอง (เช่น 6.5 µm ในกล้อง sCMOS หลายรุ่น และ 3.45 µm ในเซนเซอร์ CMOS ทั่วไป) ถูกฉายลงบนชิ้นตัวอย่างผ่านเลนส์ใกล้วัตถุและอะแดปเตอร์กล้องที่มี binning 2 × 2 รวมสี่พิกเซลเป็นหนึ่งพิกเซล ทำให้ขนาดพิกเซลเพิ่มเป็นสองเท่า เลนส์ใกล้ตาของกล้องจุลทรรศน์ไม่มีผลใด ๆ
ตัวอย่างการคำนวณ: พิกเซล 6.5 µm เลนส์ใกล้วัตถุ 60× อะแดปเตอร์ 1× ไม่ใช้ binning: 6.5 ÷ 60 = 0.108 µm ต่อพิกเซล หรือ 9.2 พิกเซลต่อ µm เปรียบเทียบค่านี้กับขนาดพิกเซลตามเกณฑ์ Nyquistของเลนส์ใกล้วัตถุของคุณ เพื่อดูว่ากล้องสุ่มตัวอย่างภาพจากระบบออปติกได้เหมาะสมหรือไม่
การปรับเทียบด้วย stage micrometer
สูตรนี้ถือว่ากำลังขยายที่ระบุนั้นแม่นยำ ซึ่งโดยทั่วไปคลาดเคลื่อนไม่เกินไม่กี่เปอร์เซ็นต์ สำหรับการวัดที่จะนำไปตีพิมพ์ ให้ปรับเทียบเลนส์ใกล้วัตถุแต่ละตัวหนึ่งครั้ง: ถ่ายภาพ stage micrometer (สไลด์ที่มีสเกลขีดแบ่ง มักเป็น 1 mm แบ่งเป็น 100 ช่อง ช่องละ 10 µm) ลากเส้นตามช่องให้ได้มากที่สุดเท่าที่พอดีกับภาพ แล้วหารความยาวจริงด้วยความยาวของเส้นเป็นพิกเซล
ตัวอย่างการคำนวณ: 100 µm บน micrometer ครอบคลุม 400 พิกเซล: 100 ÷ 400 = 0.25 µm ต่อพิกเซล ใน Fiji ใช้ Analyze › Set Scale ซึ่งให้ผลเหมือนกัน ส่วนใน SlideScope ใช้ View › Set Pixel Size… เพื่อบันทึกค่านี้ไว้สำหรับภาพนั้นเมื่อไฟล์ไม่มีข้อมูลขนาดพิกเซล
ไมครอนต่อพิกเซล (MPP) ในภาพสไลด์ทั้งแผ่น
เครื่องสแกนสไลด์บันทึกขนาดพิกเซลของระดับฐานไว้ในไฟล์ (Aperio SVS เขียนเป็น "MPP" ส่วนรูปแบบอื่นใช้แท็กที่เทียบเท่ากัน) ตามธรรมเนียม ภาพสแกน 40× มีขนาดประมาณ 0.25 µm ต่อพิกเซล และภาพสแกน 20× ประมาณ 0.5 µm ต่อพิกเซล ค่าที่แน่นอนขึ้นอยู่กับเครื่องสแกน (สไลด์ทดสอบ CMU-1 ของ OpenSlide ซึ่งเป็นภาพสแกน Aperio ที่ 20× บันทึกไว้ 0.499 µm/px) แต่ละระดับของพีระมิดจะคูณ MPP ด้วยอัตราย่อขนาด (downsample) ของระดับนั้น ดังนั้นระดับ 2 ของสไลด์ 40× ที่มี downsample 16 จะเป็น 4 µm ต่อพิกเซล เทียบเท่าประมาณ 2.5×
อ่านค่านี้ใน Python ด้วย openslide.OpenSlide(path).properties["openslide.mpp-x"] (ดูการอ่านไฟล์ SVS ด้วย Python) โปรแกรมดูบนเดสก์ท็อป รวมถึง SlideScope อ่านค่านี้โดยอัตโนมัติและใช้วาดแถบมาตราส่วน
คำถาม
คำนวณไมครอนต่อพิกเซลได้อย่างไร?
หารขนาดพิกเซลของกล้องด้วยกำลังขยายรวมระหว่างชิ้นตัวอย่างกับกล้อง (เลนส์ใกล้วัตถุ × อะแดปเตอร์กล้อง) แล้วคูณด้วย binning หรือถ่ายภาพ stage micrometer แล้วหารความยาวที่ทราบค่าด้วยความยาวเป็นพิกเซล
MPP ในพยาธิวิทยาคืออะไร?
ไมครอนต่อพิกเซล: ความกว้างของหนึ่งพิกเซลที่ชิ้นตัวอย่างในภาพสไลด์ทั้งแผ่น ตามธรรมเนียม ประมาณ 0.25 µm/px เรียกว่า 40× และ 0.5 µm/px เรียกว่า 20×
ทำไมภาพของฉันจึงแสดงแถบมาตราส่วนผิด?
ไฟล์ไม่มีข้อมูลขนาดพิกเซล หรือมีค่าที่ผิด (ไฟล์ TIFF บางไฟล์ที่ส่งออกมาบันทึกเป็น 1 พิกเซลต่อนิ้ว) ให้กำหนดขนาดพิกเซลด้วยการปรับเทียบ ใน Fiji ใช้ Analyze › Set Scale ใน SlideScope ใช้ View › Set Pixel Size…
เลนส์ใกล้ตาเปลี่ยนขนาดพิกเซลหรือไม่?
ไม่ กล้องถ่ายภาพเห็นภาพที่เกิดจากเลนส์ใกล้วัตถุ (และอะแดปเตอร์) ไม่ได้มองผ่านเลนส์ใกล้ตา
เครื่องคำนวณนี้ใช้ฟรีหรือไม่?
ใช่ เครื่องคำนวณทำงานในเบราว์เซอร์ของคุณและไม่ส่งข้อมูลใด ๆ ออกไป ส่วน SlideScope แอปกล้องจุลทรรศน์บนเดสก์ท็อปจากทีมเดียวกัน เป็นแอปแบบชำระเงินที่มีคลังภาพตัวอย่างฟรี (ใช้ได้ทุกเครื่องมือ) และต้องสมัครสมาชิกสำหรับภาพของคุณเอง
แหล่งอ้างอิง
ผลลัพธ์เป็นค่าทางทฤษฎีหรือการคำนวณทางคณิตศาสตร์ ตรวจสอบกับเอกสารของเครื่องมือของคุณก่อนนำไปใช้กับงานทางคลินิกหรืองานที่มีการกำกับดูแล
วัดบนภาพจริงของคุณ
SlideScope เปิดไฟล์จากกล้องจุลทรรศน์และเครื่องสแกนสไลด์ได้ 34 รูปแบบ รวมถึง CZI, ND2, SVS และ LIF พร้อมการปรับเทียบของไฟล์เอง ความยาว พื้นที่ จำนวนเซลล์ และแถบมาตราส่วนจึงออกมาเป็น µm โดยไม่ต้องตั้งค่าใด ๆ ลองใช้ทุกเครื่องมือฟรีกับภาพตัวอย่างในตัว ส่วนการเปิดภาพของคุณเองต้องใช้การสมัครสมาชิก ตัดสินใจแล้ว? สมัครสมาชิกเลย