אופטיקה
מחשבון רזולוציה וצמצם נומרי למיקרוסקופ
הזינו את אורך הגל ואת הצמצם הנומרי של העדשה האובייקטיבית כדי לראות עד כמה עדין הפרט שהיא מסוגלת להפריד, לרוחב ולאורך הציר האופטי, בהדמיית שדה רחב ובהדמיה קונפוקלית, וכמה קטנים הפיקסלים שלכם צריכים להיות כדי לקלוט אותו (Nyquist). בהמשך: צמצם נומרי מתוך זווית הקבלה, ועומק שדה.
נוסחאות רזולוציה, ומתי כל אחת חלה
| גבול | נוסחה | מתי משתמשים בו |
|---|---|---|
| Abbe | d = אורך גל ÷ (2 × NA) | הפרט המחזורי העדין ביותר שהעדשה האובייקטיבית מעבירה |
| Rayleigh | r = 0.61 × אורך גל ÷ NA | שני מקורות נקודתיים, עדשה אובייקטיבית וקונדנסור תואמים (או פלואורסצנציה) |
| שדה בהיר עם קונדנסור | r = 1.22 × אורך גל ÷ (NAobj + NAcond) | אור עובר כשה-NA של הקונדנסור נמוך מזה של העדשה האובייקטיבית |
| צירית, שדה רחב | z ≈ 2 × אורך גל × n ÷ NA² | עד כמה דקה הפרוסה שתמונת שדה רחב מפרידה |
| קונפוקלי, pinhole קטן | 0.37 × אורך גל ÷ NA לרוחב; 0.64 × אורך גל ÷ (n − √(n² − NA²)) צירית | FWHM כשה-pinhole קטן מ-0.25 יחידות Airy (Zeiss) |
אורך הגל הוא אורך גל הפליטה בפלואורסצנציה בשדה רחב, וממוצע של אורכי הגל של העירור והפליטה בקונפוקלי; NA הוא הצמצם הנומרי של העדשה האובייקטיבית ו-n הוא מקדם השבירה של תווך הטבילה. ההגדלה לא מופיעה בשום מקום: היא קובעת כמה גדול הפרט נראה, לא אם הוא מופרד. אלה המקרים הטובים ביותר מבחינה תיאורטית; קונדנסור לא מכוונן, ניגודיות נמוכה, דגימות עבות ואי-התאמה של מקדם השבירה מחלישים כולם את הרזולוציה בפועל.
דוגמה מחושבת: פליטה ב-520 nm ועדשה אובייקטיבית בטבילת שמן עם NA של 1.4: Rayleigh 0.61 × 520 ÷ 1.4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2.8 = 186 nm; צירית בערך 2 × 520 × 1.518 ÷ 1.96 = 805 nm.
דגימת Nyquist: כמה קטנים הפיקסלים צריכים להיות
כדי לתעד פרט שהאופטיקה מפרידה, גודל הפיקסל בדגימה חייב להיות לכל היותר חצי מהמחזור הקטן ביותר שמופרד. מקור ה-Nyquist של SVI נותן את מרחק הדגימה הקריטי כ-אורך גל הפליטה ÷ (4 × NA) בשדה רחב וכ-אורך גל העירור ÷ (8 × NA) בקונפוקלי; מתקנים רבים פשוט מחלקים את הרזולוציה ב-2.3 כמרווח ביטחון. פיקסלים גדולים יותר מאבדים פרטים לצמיתות (תת-דגימה); פיקסלים קטנים בהרבה רק עולים באור, בזמן ובשטח דיסק, אלא אם אתם מתכננים לבצע דקונבולוציה.
בדקו את גודל הפיקסל בפועל בעזרת מחשבון גודל הפיקסל: פיקסל מצלמה של 6.5 µm מאחורי עדשה אובייקטיבית של 60× הוא 108 nm בדגימה, מה שדוגם אור של 520 nm ב-NA של 1.4 (Nyquist 93 nm) מעט בגסות.
צמצם נומרי
NA = n × sin(חצי הזווית)
חצי הזווית הוא מחצית מזווית הפתיחה של קונוס האור שהעדשה האובייקטיבית קולטת, ו-n הוא מקדם השבירה בין זכוכית הכיסוי לעדשה הקדמית. באוויר NA לא יכול להגיע ל-1; עדשות אובייקטיביות יבשות בפועל נעצרות בערך ב-0.95. טבילה במים מגיעה לכ-1.27, שמן סיליקון לכ-1.35, וטבילה בשמן לכ-1.4 עד 1.49. ה-NA של עדשה אובייקטיבית חרוט אחרי ההגדלה שלה, למשל "60×/1.40 Oil".
עומק שדה (MicroscopyU): d = אורך גל × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), כאשר e הוא המרחק הקטן ביותר שהגלאי מפריד (בערך פיקסל מצלמה) ו-M היא הגדלת העדשה האובייקטיבית. לעדשות אובייקטיביות עם NA גבוה יש עומק שדה רדוד מאוד, ולכן חתך עבה דורש ערימת Z.
שאלות
מהי הרזולוציה של מיקרוסקופ אור?
בערך 200–250 nm לרוחב עם עדשה אובייקטיבית בטבילת שמן עם NA גבוה באור נראה (0.61 × 520 nm ÷ 1.4 ≈ 227 nm לפי קריטריון Rayleigh), ובערך 500–800 nm לאורך הציר האופטי.
מה ההבדל בין גבול Abbe לגבול Rayleigh?
Abbe (אורך גל ÷ 2NA) הוא המבנה המחזורי העדין ביותר שעדשה אובייקטיבית מעבירה; Rayleigh (0.61 × אורך גל ÷ NA) הוא המרחק שבו עוד אפשר בקושי להבחין בין שני מקורות נקודתיים. שניהם תלויים ביחס אורך גל ÷ NA; Rayleigh הוא המספר השמרני יותר.
איך מחשבים צמצם נומרי?
NA = n × sin(חצי הזווית), כאשר n הוא מקדם השבירה של תווך הטבילה וחצי הזווית הוא מחצית מזווית הפתיחה של קונוס האור. לעדשה אובייקטיבית יבשה שקולטת חצי זווית של 64° יש NA = sin 64° ≈ 0.90.
איזה גודל פיקסל דרוש לדגימת Nyquist?
לכל היותר אורך גל ÷ (4 × NA) בדגימה בשדה רחב (אורך גל הפליטה), ואורך גל ÷ (8 × NA) בקונפוקלי (אורך גל העירור). עבור 520 nm ו-NA של 1.4 זה בערך 93 nm (שדה רחב) או 46 nm (קונפוקלי).
האם הגדלה גבוהה יותר נותנת רזולוציה טובה יותר?
לא. הרזולוציה נקבעת על ידי ה-NA ואורך הגל. הגדלה גבוהה יותר בלי NA גבוה יותר מגדילה את אותו טשטוש ("הגדלה ריקה").
האם המחשבון הזה חינמי?
כן. הוא רץ בדפדפן שלכם ולא שולח דבר לשום מקום. SlideScope, אפליקציית המיקרוסקופיה למחשב של אותו צוות, היא אפליקציה בתשלום עם ספריית דוגמאות חינמית (כל הכלים) ומנוי לתמונות שלכם.
מקורות
- Nikon MicroscopyU — Resolution
- Nikon MicroscopyU — עומק שדה ועומק מוקד
- ZEISS — יסודות מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית (Wilhelm)
- SVI Huygens — קצב Nyquist
התוצאות תיאורטיות או חשבוניות; בדקו אותן מול התיעוד של המכשיר שלכם לפני שתסתמכו עליהן בעבודה קלינית או מפוקחת.
מדדו על התמונות האמיתיות שלכם
SlideScope פותח 34 פורמטים של מיקרוסקופים וסורקי שקופיות, ביניהם CZI, ND2, SVS ו-LIF, עם הכיול שלהם, כך שאורכים, שטחים, ספירות תאים ופסי קנה מידה מתקבלים ב-µm בלי להגדיר דבר. נסו כל כלי בחינם על הדוגמאות המובנות; כדי לפתוח את התמונות שלכם נדרש מנוי. כבר החלטתם? הירשמו למנוי עכשיו.