Calcolatore dell’indice Ki-67

Calcolatore dell’indice Ki-67

Come si calcola l’indice Ki-67

Ki-67 è una proteina nucleare presente nelle cellule che si trovano nel ciclo cellulare e assente nelle cellule quiescenti, quindi la quota di nuclei tumorali che si colora per Ki-67 è una misura della proliferazione. L’indice Ki-67 (detto anche indice di marcatura o indice di proliferazione) è quella quota espressa in percentuale.

Indice Ki-67 (%) = nuclei tumorali positivi ÷ (nuclei tumorali positivi + negativi) × 100

Esempio svolto: 180 nuclei tumorali marroni (positivi) e 820 blu (negativi) fanno 1.000 nuclei in tutto, quindi l’indice è 180 ÷ 1.000 × 100 = 18 %. Un conteggio di 1.000 nuclei permette di collocarlo solo tra circa il 15,7 % e il 20,5 %; lo stesso 18 % ottenuto da 200 nuclei potrebbe trovarsi ovunque tra circa il 13 % e il 24 %.

Di solito qualsiasi colorazione nucleare al di sopra del fondo conta come positiva, qualunque sia la sua intensità; si contano solo i nuclei tumorali, non linfociti, stroma o endotelio.

Dove contare: sezione intera o hot spot

La colorazione per Ki-67 è raramente uniforme, quindi il punto in cui conti cambia la risposta più dell’aritmetica. Usa il metodo indicato dalla linea guida per il tuo tipo di tumore e dichiara quale hai usato.

• Globale (carcinoma mammario): l’International Ki67 in Breast Cancer Working Group raccomanda un metodo visivo standardizzato che valuta campi rappresentativi della gamma di colorazione sull’intera sezione e registra un punteggio globale ponderato, anziché il solo hot spot, che variava di più tra osservatori.
• Hot spot (tumori neuroendocrini): per il grading l’indice si legge nell’area di marcatura più alta, contando lì almeno 500 cellule tumorali, e molti laboratori contano su un’immagine stampata o acquisita anziché a occhio.
• La stima a occhio è il metodo più debole: le stime senza conteggio sono quelle che variano di più tra osservatori. Contare su un’immagine acquisita, o con un’analisi d’immagine che hai verificato, è più ripetibile.

Per lo stesso gruppo di lavoro, valori pari o inferiori al 5 % e pari o superiori al 30 % erano gli intervalli in cui il Ki-67 è stato giudicato abbastanza affidabile da orientare la prognosi nel carcinoma mammario in fase iniziale; i valori intermedi concordavano meno tra laboratori. Le soglie cliniche spettano alla linea guida del tipo di tumore, non a questa pagina.

Quanti nuclei contare

Un conteggio è un campione, e la sua incertezza si riduce con la radice quadrata del numero contato. L’intervallo mostrato dal calcolatore è l’intervallo di Wilson per una proporzione. Per la pianificazione basta la consueta approssimazione normale: per un indice atteso p e un margine desiderato di ± m (entrambi come frazioni), i nuclei necessari per un intervallo al 95 % sono circa:

n = 1,96² × p × (1 − p) ÷ m²

Questo è solo l’errore di conteggio. Non dice nulla su quali campi hai scelto né su dove hai tracciato il confine tra positivo e negativo, ed è per questo che un metodo fisso conta più di un conteggio molto grande.

Ottenere lo stesso punteggio con un software

Il software di analisi d’immagine arriva a questi punteggi con la stessa aritmetica, sostituendo l’occhio con una misura. Trova ogni nucleo nella regione, separa la colorazione marrone del DAB da quella blu dell’ematossilina con la deconvoluzione del colore, misura la densità ottica DAB media di ogni nucleo e gli assegna un grado rispetto a soglie che imposti tu: una soglia per positivo o negativo, tre per 1+, 2+ e 3+.

• QuPath (gratuito, open source): la Positive cell detection con una soglia dà la percentuale di positivi; con tre soglie riporta anche l’H-score.
• Fiji / ImageJ (gratuito): Colour Deconvolution con i vettori H DAB, poi soglia e conteggio; l’aritmetica del punteggio spetta a te.
• SlideScope: conta i nuclei nella regione che scegli, assegna a ciascuno un grado e riporta insieme percentuale di positivi, H-score e punteggio di Allred, con le stesse definizioni di QuPath. Puoi anche fare la domanda in linguaggio semplice con Ask Your Slide; ogni numero proviene dallo strumento locale, con i contorni da controllare. Solo per uso di ricerca.

Qualunque strumento usi, le soglie sono scelte: scrivile nei metodi, confronta i contorni con l’immagine e mantienile fisse su tutti i vetrini che confronti. Passo per passo: come quantificare la colorazione IHC.

Domande

Fonti

• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021;113(7):808-819
• Trikalinos NA et al. Accuracy of grading in pancreatic neuroendocrine neoplasms and effect on survival estimates. Ann Surg Oncol 2020 (conteggio nell’hot spot di almeno 500 cellule)
• Documentazione di QuPath: indice di marcatura Ki67 con la rilevazione delle cellule positive
• NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods, 7.2.4.1: intervalli di confidenza per una proporzione (il metodo di Wilson)

Questi calcolatori eseguono calcoli per la ricerca e la didattica. Non sono uno strumento diagnostico: la valutazione per la cura del paziente segue il saggio validato, la linea guida attuale per quel marcatore e il giudizio di un patologo.