Come quantificare la colorazione IHC

Decidi che cosa misurare

Scegli la misura prima di guardare i risultati e usa la stessa per tutti i campioni. Per un indice basato su un conteggio, il calcolatore dell’indice Ki-67 mostra di quanto può sbagliare un conteggio di una data dimensione.

Software per la quantificazione IHC

Un confronto più ampio degli strumenti di analisi è nel confronto dei software di analisi di immagini di microscopia.

Come quantificare l’IHC in QuPath

1. Apri il vetrino e imposta il tipo di immagine su Brightfield (H-DAB), così QuPath separa l’ematossilina dal DAB.
2. Disegna un’annotazione intorno al tessuto da valutare. Evita di valutare l’intera immagine: pieghe, bordi e sfondo falsano il risultato.
3. Esegui Analyze › Cell detection › Positive cell detection sull’annotazione. Verifica che i nuclei rilevati corrispondano all’immagine e regola le impostazioni di rilevazione se i nuclei risultano fusi o mancati.
4. Per un marcatore nucleare imposta Score compartment su Nucleus: DAB OD mean. Una sola soglia divide le cellule in positive e negative; fino a tre soglie le classificano come deboli, moderate e forti (1+, 2+, 3+).
5. Leggi Positive % per l’annotazione nella scheda Annotations. Con tre soglie QuPath calcola anche l’H-score, da 0 a 300.
6. Apri Measure › Show annotation measurements, esporta la tabella in CSV per le tue statistiche e annota le soglie nei metodi.

Le stesse soglie di intensità si possono modificare in seguito con Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, senza rilevare di nuovo le cellule.

Come quantificare la colorazione DAB in Fiji (ImageJ)

1. Apri l’immagine RGB in campo chiaro. Un vetrino intero di solito è troppo grande per essere aperto a piena risoluzione, quindi esportane prima una regione o un campo.
2. Esegui Image › Color › Colour Deconvolution e scegli i vettori H DAB. Ottieni tre immagini: ematossilina, DAB e un residuo.
3. Per l’area colorata: sull’immagine DAB imposta una soglia con Image › Adjust › Threshold, spunta Area fraction e Limit to threshold in Analyze › Set Measurements, poi esegui Analyze › Measure.
4. Per la percentuale di cellule positive: conta i nuclei sulle immagini dell’ematossilina e del DAB (soglia, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles), poi dividi i nuclei positivi per tutti i nuclei.
5. Usa gli stessi valori di soglia per ogni immagine e registra i passaggi come macro, così il lotto è ripetibile.

L’autore del plugin avverte di non interpretare l’intensità del DAB come una quantità di antigene: il DAB non segue la legge di Beer-Lambert e l’immunocolorazione non è stechiometrica. Confronta l’intensità solo all’interno di una stessa seduta di colorazione e preferisci contare le cellule positive o misurare l’area piuttosto che confrontare l’intensità grezza.

Come valutare l’IHC in SlideScope (senza codice)

1. Apri il vetrino in SlideScope su Windows o Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF e gli altri formati che legge) e disegna la regione da valutare o ingrandiscila.
2. Apri Quantify, imposta Objects sui nuclei e Stains su Hematoxylin + DAB (IHC). Se i colori della tua colorazione differiscono da quelli predefiniti, stima i vettori di colorazione dal vetrino.
3. In Marker classification, attiva Classify marker-positive objects con il DAB come marcatore positivo. Le tre soglie di grado (1+, 2+, 3+, in densità ottica) partono da 0,2; 0,4 e 0,6 e si possono modificare.
4. Avvia l’analisi. Ogni nucleo viene delineato sull’immagine, così puoi controllare il risultato, correggere la classe di un nucleo o escludere ciò che è stato letto male.
5. Leggi percentuale di positivi, H-score, punteggio di Allred e cellule positive per mm² della regione, poi esporta la tabella degli oggetti (CSV), i contorni (GeoJSON, che si apre in QuPath) e un riepilogo dei metodi.

Oppure scrivi la domanda. Con Ask Your Slide puoi chiedere “che percentuale di nuclei è Ki67-positiva in questa regione?” oppure “dammi l’H-score e il punteggio di Allred dell’area che ho delineato”, e SlideScope esegue questi stessi strumenti sul tuo computer e mostra le prove di ogni numero. I punteggi usano le stesse definizioni di QuPath, quindi i due concordano sulle stesse cellule. La valutazione assegna un grado ai nuclei, il che si adatta ai marcatori nucleari; i risultati sono per uso di ricerca e richiedono la tua verifica visiva. Altro nella pagina sul conteggio.

Che cosa determina se il numero è corretto

• Dove si trova il marcatore: la valutazione basata sui nuclei si adatta ai marcatori nucleari come Ki-67, ER, PR e p53. I marcatori di membrana (HER2, PD-L1) e citoplasmatici richiedono che la colorazione sia misurata in quel compartimento, e la loro valutazione clinica segue il manuale del saggio.
• Soglie fissate sui controlli: stabilisci la soglia di positività su tessuto di controllo della stessa seduta di colorazione, prima di valutare l’esperimento, e non modificarla mai da un vetrino all’altro.
• La regione: valuta il tessuto a cui si riferisce la domanda ed escludi necrosi, pieghe, colorazione dei bordi e stroma, a meno che il protocollo non li includa. Hot spot e sezioni intere danno numeri diversi; dichiara quale hai usato.
• Controlla la rilevazione: guarda i contorni. I nuclei fusi abbassano il conteggio e quelli divisi lo alzano; un tessuto affollato richiede un rilevatore deep learning o impostazioni regolate.
• Abbastanza cellule, la n giusta: valuta alcune centinaia di cellule per campione ed esegui le statistiche su un valore per animale o paziente, non su cellule o campi.
• Riportalo: software e versione, vettori di colorazione, soglie, regola di scelta della regione, cellule contate e chi ha verificato il risultato.

Domande

Fonti

• Documentazione di QuPath: rilevazione delle cellule, Positive cell detection e Score compartment
• Documentazione di QuPath: classificazione delle cellule, soglie di intensità, Positive % e H-score
• Documentazione di ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: i vettori H DAB, e perché l’intensità del DAB non è una misura dell’antigene
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Questa guida è per la ricerca e la didattica. Non è una procedura diagnostica: la valutazione per la cura del paziente segue il saggio validato, la linea guida attuale per quel marcatore e il giudizio di un patologo.