Оптика
Калькулятор роздільної здатності мікроскопа та числової апертури
Введіть довжину хвилі та числову апертуру об’єктива, щоб побачити, наскільки дрібні деталі він здатен розрізнити в латеральній площині та вздовж оптичної осі для широкопольної й конфокальної мікроскопії, а також якими малими мають бути ваші пікселі, щоб їх зафіксувати (Найквіст). Нижче: числова апертура за кутом апертури та глибина різкості.
Формули роздільної здатності та коли кожна з них застосовується
| Межа | Формула | Для чого використовувати |
|---|---|---|
| Аббе | d = довжина хвилі ÷ (2 × NA) | Найдрібніша періодична деталь, яку пропускає об’єктив |
| Релей | r = 0.61 × довжина хвилі ÷ NA | Два точкові джерела, об’єктив і конденсор узгоджені (або флуоресценція) |
| Світле поле з конденсором | r = 1.22 × довжина хвилі ÷ (NAobj + NAcond) | Прохідне світло, коли NA конденсора менша, ніж в об’єктива |
| Осьова, широке поле | z ≈ 2 × довжина хвилі × n ÷ NA² | Наскільки тонкий шар відокремлює широкопольне зображення |
| Конфокальна, малий пінгол | 0.37 × довжина хвилі ÷ NA латерально; 0.64 × довжина хвилі ÷ (n − √(n² − NA²)) аксіально | FWHM за пінгола менше 0.25 одиниці Ейрі (Zeiss) |
Довжина хвилі означає довжину хвилі емісії для широкопольної флуоресценції та середнє значення збудження й емісії для конфокальної мікроскопії; NA — числова апертура об’єктива, а n — показник заломлення імерсійного середовища. Збільшення ніде не фігурує: воно визначає, наскільки великою виглядає деталь, а не те, чи її розрізнено. Це теоретично найкращі випадки; неправильно відцентрований конденсор, низький контраст, товсті зразки й невідповідність показників заломлення погіршують реальну роздільну здатність.
Приклад розрахунку: емісія 520 нм і олійний об’єктив з NA 1.4: Релей 0.61 × 520 ÷ 1.4 = 227 нм; Аббе 520 ÷ 2.8 = 186 нм; осьова приблизно 2 × 520 × 1.518 ÷ 1.96 = 805 нм.
Дискретизація за Найквістом: якими малими мають бути пікселі
Щоб зафіксувати деталі, які розрізняє оптика, розмір пікселя на зразку має становити щонайбільше половину найменшого розрізненого періоду. Довідник SVI щодо Найквіста наводить критичну відстань дискретизації як довжина хвилі емісії ÷ (4 × NA) для широкого поля та довжина хвилі збудження ÷ (8 × NA) для конфокальної мікроскопії; багато центрів колективного користування просто ділять роздільну здатність на 2.3 із запасом. Більші пікселі безповоротно втрачають деталі (недостатня дискретизація); значно менші лише коштують світла, часу та місця на диску, якщо ви не плануєте деконволюцію.
Перевірте свій фактичний розмір пікселя за допомогою калькулятора розміру пікселя: піксель камери 6.5 мкм за об’єктивом 60× дає 108 нм на зразку, що дискретизує світло 520 нм при NA 1.4 (Найквіст 93 нм) трохи грубо.
Числова апертура
NA = n × sin(півкут)
Півкут — це половина кута розкриття конуса світла, який приймає об’єктив, а n — показник заломлення між покривним склом і фронтальною лінзою. У повітрі NA не може досягти 1; реальні сухі об’єктиви зупиняються приблизно на 0.95. Водна імерсія досягає приблизно 1.27, силіконова олія — приблизно 1.35, а олійна імерсія — приблизно 1.4–1.49. NA об’єктива вигравіювано після його збільшення, наприклад «60×/1.40 Oil».
Глибина різкості (MicroscopyU): d = довжина хвилі × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), де e — найменша відстань, яку розрізняє детектор (приблизно піксель камери), а M — збільшення об’єктива. Об’єктиви з високою NA мають дуже малу глибину різкості, тому для товстого зрізу потрібен Z-стек.
Запитання
Яка роздільна здатність світлового мікроскопа?
Приблизно 200–250 нм латерально з олійним об’єктивом з високою NA у видимому світлі (0.61 × 520 нм ÷ 1.4 ≈ 227 нм за критерієм Релея) і приблизно 500–800 нм уздовж оптичної осі.
Яка різниця між межами Аббе і Релея?
Межа Аббе (довжина хвилі ÷ 2NA) — це найдрібніша періодична структура, яку пропускає об’єктив; межа Релея (0.61 × довжина хвилі ÷ NA) — відстань, на якій два точкові джерела ще можна розрізнити. Обидві масштабуються як довжина хвилі ÷ NA; межа Релея консервативніша.
Як обчислити числову апертуру?
NA = n × sin(півкут), де n — показник заломлення імерсійного середовища, а півкут — половина кута розкриття світлового конуса. Сухий об’єктив, що приймає півкут 64°, має NA = sin 64° ≈ 0.90.
Який розмір пікселя потрібен для дискретизації за Найквістом?
Щонайбільше довжина хвилі ÷ (4 × NA) на препараті для широкого поля (довжина хвилі емісії) і довжина хвилі ÷ (8 × NA) для конфокальної мікроскопії (довжина хвилі збудження). Для 520 нм і NA 1.4 це приблизно 93 нм (широке поле) або 46 нм (конфокальна).
Чи дає більше збільшення кращу роздільну здатність?
Ні. Роздільну здатність визначають NA і довжина хвилі. Більше збільшення без вищої NA лише збільшує те саме розмиття («порожнє збільшення»).
Чи цей калькулятор безкоштовний?
Так. Він працює у вашому браузері й нікуди нічого не надсилає. SlideScope, настільна програма для мікроскопії від тієї самої команди, — платна програма з безкоштовною бібліотекою зразків (усі інструменти) і передплатою для ваших власних зображень.
Джерела
- Nikon MicroscopyU — Resolution
- Nikon MicroscopyU — Depth of field and depth of focus
- ZEISS — Basics of confocal laser scanning microscopy (Wilhelm)
- SVI Huygens — The Nyquist rate
Результати теоретичні або арифметичні; звірте їх із документацією вашого приладу, перш ніж покладатися на них у клінічній або регульованій роботі.
Вимірюйте на своїх реальних зображеннях
SlideScope відкриває 34 формати мікроскопів і слайд-сканерів, серед них CZI, ND2, SVS і LIF, з їхнім власним калібруванням, тож довжини, площі, кількість клітин і масштабні лінійки виходять у мкм без жодного налаштування. Спробуйте всі інструменти безкоштовно на вбудованих зразках; щоб відкривати власні зображення, потрібна передплата. Уже вирішили? Оформити передплату зараз.