Óptica
Calculadora de resolução e abertura numérica do microscópio
Informe o comprimento de onda e a abertura numérica (NA) da objetiva para ver o quão fino é o detalhe que ela consegue separar, lateralmente e ao longo do eixo óptico, em imagens de campo amplo e confocais, e o quão pequenos seus pixels precisam ser para registrá-lo (Nyquist). Mais abaixo: a abertura numérica a partir do ângulo de aceitação e a profundidade de campo.
Fórmulas de resolução e quando cada uma se aplica
| Limite | Fórmula | Use para |
|---|---|---|
| Abbe | d = comprimento de onda ÷ (2 × NA) | O detalhe periódico mais fino que a objetiva transmite |
| Rayleigh | r = 0,61 × comprimento de onda ÷ NA | Duas fontes pontuais, com objetiva e condensador equivalentes (ou fluorescência) |
| Campo claro com condensador | r = 1,22 × comprimento de onda ÷ (NAobj + NAcond) | Luz transmitida quando a NA do condensador é menor que a da objetiva |
| Axial, campo amplo | z ≈ 2 × comprimento de onda × n ÷ NA² | Quão fina é a fatia que uma imagem de campo amplo consegue separar |
| Confocal, pinhole pequeno | 0,37 × comprimento de onda ÷ NA lateral; 0,64 × comprimento de onda ÷ (n − √(n² − NA²)) axial | FWHM com o pinhole abaixo de 0,25 unidade de Airy (Zeiss) |
O comprimento de onda é o de emissão, na fluorescência de campo amplo, e a média entre excitação e emissão, na confocal; NA é a abertura numérica da objetiva e n, o índice de refração do meio de imersão. A ampliação não aparece em nenhuma fórmula: ela define o tamanho com que o detalhe aparece, não se ele é resolvido. Esses são os melhores casos teóricos; um condensador desalinhado, baixo contraste, amostras espessas e incompatibilidade de índice de refração pioram a resolução real.
Exemplo resolvido: emissão de 520 nm e uma objetiva de óleo com NA 1,4: Rayleigh 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2,8 = 186 nm; axial cerca de 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 nm.
Amostragem de Nyquist: o quão pequenos seus pixels precisam ser
Para registrar o detalhe que a óptica resolve, o tamanho do pixel na amostra deve ser no máximo metade do menor período resolvido. A referência de Nyquist da SVI define a distância crítica de amostragem como comprimento de onda de emissão ÷ (4 × NA) para campo amplo e comprimento de onda de excitação ÷ (8 × NA) para confocal; muitas facilities simplesmente dividem a resolução por 2,3 como margem de segurança. Pixels maiores perdem detalhe de forma definitiva (subamostragem); pixels muito menores só custam luz, tempo e espaço em disco, a menos que você pretenda fazer deconvolução.
Confira o tamanho real do seu pixel com a calculadora de tamanho de pixel: um pixel de câmera de 6,5 µm atrás de uma objetiva de 60× equivale a 108 nm na amostra, o que amostra luz de 520 nm com NA 1,4 (Nyquist 93 nm) de forma um pouco grosseira.
Abertura numérica
NA = n × sen(semiângulo)
O semiângulo é metade do ângulo de abertura do cone de luz que a objetiva aceita, e n é o índice de refração entre a lamínula e a lente frontal. No ar, a NA não chega a 1; objetivas secas reais param em cerca de 0,95. A imersão em água chega a cerca de 1,27, o óleo de silicone a cerca de 1,35 e a imersão em óleo a cerca de 1,4 a 1,49. A NA de uma objetiva vem gravada depois da ampliação, por exemplo "60×/1.40 Oil".
Profundidade de campo (MicroscopyU): d = comprimento de onda × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), em que e é a menor distância que o detector resolve (cerca de um pixel da câmera) e M é a ampliação da objetiva. Objetivas de NA alta têm uma profundidade de campo muito rasa, e é por isso que um corte espesso precisa de uma pilha Z.
Perguntas
Qual é a resolução de um microscópio óptico?
Cerca de 200–250 nm na lateral com uma objetiva de óleo de NA alta em luz visível (0,61 × 520 nm ÷ 1,4 ≈ 227 nm pelo critério de Rayleigh) e aproximadamente 500–800 nm ao longo do eixo óptico.
Qual é a diferença entre os limites de Abbe e de Rayleigh?
Abbe (comprimento de onda ÷ 2NA) é a estrutura periódica mais fina que uma objetiva transmite; Rayleigh (0,61 × comprimento de onda ÷ NA) é a distância em que duas fontes pontuais mal conseguem ser distinguidas. Ambos variam com comprimento de onda ÷ NA; o de Rayleigh é o valor mais conservador.
Como calcular a abertura numérica?
NA = n × sen(semiângulo), em que n é o índice de refração do meio de imersão e o semiângulo é metade do ângulo de abertura do cone de luz. Uma objetiva seca que aceita um semiângulo de 64° tem NA = sen 64° ≈ 0,90.
De que tamanho de pixel preciso para a amostragem de Nyquist?
No máximo comprimento de onda ÷ (4 × NA) na amostra para campo amplo (comprimento de onda de emissão) e comprimento de onda ÷ (8 × NA) para confocal (comprimento de onda de excitação). Para 520 nm e NA 1,4, isso dá cerca de 93 nm (campo amplo) ou 46 nm (confocal).
Uma ampliação maior dá uma resolução melhor?
Não. A resolução é definida pela NA e pelo comprimento de onda. Uma ampliação maior sem NA maior só aumenta o mesmo borrão ("ampliação vazia").
Esta calculadora é gratuita?
Sim. Ela roda no seu navegador e não envia nada a lugar nenhum. O SlideScope, o aplicativo de microscopia para desktop feito pela mesma equipe, é um aplicativo pago com uma biblioteca de amostras gratuita (todas as ferramentas) e uma assinatura para suas próprias imagens.
Fontes
- Nikon MicroscopyU — Resolução
- Nikon MicroscopyU — Profundidade de campo e profundidade de foco
- ZEISS — Fundamentos da microscopia confocal de varredura a laser (Wilhelm)
- SVI Huygens — A taxa de Nyquist
Os resultados são teóricos ou aritméticos; confira-os com a documentação do seu instrumento antes de usá-los em trabalhos clínicos ou regulamentados.
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