Quang học
Công cụ tính độ phân giải và khẩu độ số của kính hiển vi
Nhập bước sóng và khẩu độ số (NA) của vật kính để xem nó có thể phân tách chi tiết nhỏ đến mức nào, theo chiều ngang và dọc theo trục quang học, cho ảnh trường rộng và đồng tiêu, và pixel của bạn phải nhỏ đến đâu để ghi lại được chi tiết đó (Nyquist). Bên dưới: khẩu độ số từ góc tiếp nhận, và độ sâu trường ảnh.
Các công thức độ phân giải, và khi nào dùng công thức nào
| Giới hạn | Công thức | Dùng cho |
|---|---|---|
| Abbe | d = bước sóng ÷ (2 × NA) | Chi tiết tuần hoàn nhỏ nhất mà vật kính truyền qua được |
| Rayleigh | r = 0,61 × bước sóng ÷ NA | Hai nguồn điểm, vật kính và tụ quang khớp nhau (hoặc huỳnh quang) |
| Trường sáng có tụ quang | r = 1,22 × bước sóng ÷ (NAobj + NAcond) | Ánh sáng truyền qua khi NA của tụ quang thấp hơn NA của vật kính |
| Trục, trường rộng | z ≈ 2 × bước sóng × n ÷ NA² | Độ mỏng của lát cắt quang học mà ảnh trường rộng phân tách được |
| Đồng tiêu, pinhole nhỏ | 0,37 × bước sóng ÷ NA theo chiều ngang; 0,64 × bước sóng ÷ (n − √(n² − NA²)) theo trục | FWHM với pinhole dưới 0,25 đơn vị Airy (Zeiss) |
Bước sóng là bước sóng phát xạ với huỳnh quang trường rộng, và là trung bình của bước sóng kích thích và phát xạ với đồng tiêu; NA là khẩu độ số của vật kính và n là chiết suất của môi trường ngâm. Độ phóng đại không xuất hiện ở đâu cả: nó quyết định chi tiết trông lớn đến đâu, chứ không quyết định chi tiết có được phân giải hay không. Đây là các trường hợp tốt nhất về mặt lý thuyết; tụ quang lệch trục, độ tương phản thấp, mẫu dày và chiết suất không khớp đều làm độ phân giải thực tế kém đi.
Ví dụ minh họa: phát xạ 520 nm và vật kính dầu NA 1,4: Rayleigh 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2,8 = 186 nm; theo trục khoảng 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 nm.
Lấy mẫu Nyquist: pixel của bạn phải nhỏ đến mức nào
Để ghi lại chi tiết mà hệ quang học phân giải được, kích thước pixel tại mẫu tối đa phải bằng một nửa chu kỳ nhỏ nhất được phân giải. Tài liệu tham khảo về Nyquist của SVI đưa ra khoảng cách lấy mẫu tới hạn là bước sóng phát xạ ÷ (4 × NA) cho trường rộng và bước sóng kích thích ÷ (8 × NA) cho đồng tiêu; nhiều cơ sở đơn giản chia độ phân giải cho 2,3 để có biên an toàn. Pixel lớn hơn sẽ làm mất chi tiết vĩnh viễn (lấy mẫu thiếu); pixel nhỏ hơn nhiều chỉ tốn thêm ánh sáng, thời gian và dung lượng ổ đĩa, trừ khi bạn định giải chập (deconvolution).
Kiểm tra kích thước pixel thực tế của bạn bằng công cụ tính kích thước pixel: pixel camera 6,5 µm sau vật kính 60× tương ứng 108 nm tại mẫu, tức lấy mẫu ánh sáng 520 nm ở NA 1,4 (Nyquist 93 nm) hơi thô một chút.
Khẩu độ số
NA = n × sin(nửa góc mở)
Nửa góc mở là một nửa góc mở của nón sáng mà vật kính tiếp nhận, và n là chiết suất giữa lá kính và thấu kính trước. Trong không khí NA không thể đạt 1; các vật kính khô thực tế dừng ở khoảng 0,95. Ngâm nước đạt khoảng 1,27, dầu silicone khoảng 1,35, và ngâm dầu khoảng 1,4 đến 1,49. NA của vật kính được khắc ngay sau độ phóng đại, ví dụ "60×/1.40 Oil".
Độ sâu trường ảnh (MicroscopyU): d = bước sóng × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), trong đó e là khoảng cách nhỏ nhất mà đầu thu phân giải được (khoảng một pixel camera) và M là độ phóng đại của vật kính. Vật kính NA cao có độ sâu trường ảnh rất nông, đó là lý do một lát cắt dày cần chụp chồng Z.
Câu hỏi
Độ phân giải của kính hiển vi quang học là bao nhiêu?
Khoảng 200–250 nm theo chiều ngang với vật kính dầu NA cao trong ánh sáng khả kiến (0,61 × 520 nm ÷ 1,4 ≈ 227 nm theo tiêu chuẩn Rayleigh), và khoảng 500–800 nm dọc theo trục quang học.
Giới hạn Abbe và giới hạn Rayleigh khác nhau thế nào?
Abbe (bước sóng ÷ 2NA) là cấu trúc tuần hoàn nhỏ nhất mà vật kính truyền qua được; Rayleigh (0,61 × bước sóng ÷ NA) là khoảng cách mà tại đó hai nguồn điểm vừa đủ phân biệt được với nhau. Cả hai đều tỷ lệ với bước sóng ÷ NA; Rayleigh là con số thận trọng hơn.
Làm thế nào để tính khẩu độ số?
NA = n × sin(nửa góc mở), trong đó n là chiết suất của môi trường ngâm và nửa góc mở là một nửa góc mở của nón sáng. Một vật kính khô tiếp nhận nửa góc 64° có NA = sin 64° ≈ 0,90.
Cần kích thước pixel bao nhiêu để lấy mẫu Nyquist?
Tối đa là bước sóng ÷ (4 × NA) tại mẫu vật với trường rộng (bước sóng phát xạ), và bước sóng ÷ (8 × NA) với đồng tiêu (bước sóng kích thích). Với 520 nm và NA 1,4, con số đó là khoảng 93 nm (trường rộng) hoặc 46 nm (đồng tiêu).
Độ phóng đại cao hơn có cho độ phân giải tốt hơn không?
Không. Độ phân giải do NA và bước sóng quyết định. Độ phóng đại cao hơn mà không tăng NA chỉ phóng to cùng một vùng nhòe ("độ phóng đại rỗng").
Máy tính này có miễn phí không?
Có. Công cụ chạy trong trình duyệt của bạn và không gửi gì đi đâu cả. SlideScope, ứng dụng hiển vi trên máy tính do cùng đội ngũ phát triển, là ứng dụng trả phí có thư viện mẫu miễn phí (với mọi công cụ) và gói thuê bao cho ảnh của riêng bạn.
Nguồn
- Nikon MicroscopyU — Độ phân giải
- Nikon MicroscopyU — Độ sâu trường ảnh và độ sâu tiêu điểm
- ZEISS — Cơ bản về kính hiển vi quét laser đồng tiêu (Wilhelm)
- SVI Huygens — Tần số Nyquist
Kết quả mang tính lý thuyết hoặc số học; hãy đối chiếu với tài liệu của thiết bị trước khi dựa vào chúng cho công việc lâm sàng hoặc công việc chịu quản lý.
Đo trên ảnh thực của bạn
SlideScope mở 34 định dạng của kính hiển vi và máy quét tiêu bản, trong đó có CZI, ND2, SVS và LIF, với hiệu chuẩn riêng của từng tệp, nên chiều dài, diện tích, số đếm tế bào và thanh tỷ lệ đều ra theo µm mà không cần thiết lập gì. Dùng thử miễn phí mọi công cụ trên các mẫu tích hợp; để mở ảnh của riêng bạn, bạn cần một gói thuê bao. Đã quyết định? Đăng ký ngay.