Óptica
Calculadora de resolución del microscopio y apertura numérica
Ingresa la longitud de onda y la apertura numérica del objetivo para ver qué tan fino es el detalle que puede separar, en el plano lateral y a lo largo del eje óptico, en imágenes de campo amplio y confocales, y qué tan pequeños deben ser tus píxeles para capturarlo (Nyquist). Más abajo: la apertura numérica a partir del ángulo de aceptación, y la profundidad de campo.
Fórmulas de resolución y cuándo se aplica cada una
| Límite | Fórmula | Úsala para |
|---|---|---|
| Abbe | d = longitud de onda ÷ (2 × AN) | El detalle periódico más fino que deja pasar el objetivo |
| Rayleigh | r = 0.61 × longitud de onda ÷ AN | Dos fuentes puntuales, con objetivo y condensador de igual AN (o fluorescencia) |
| Campo claro con condensador | r = 1.22 × longitud de onda ÷ (ANobj + ANcond) | Luz transmitida cuando la AN del condensador es menor que la del objetivo |
| Axial, campo amplio | z ≈ 2 × longitud de onda × n ÷ AN² | Qué tan delgado es el corte que separa una imagen de campo amplio |
| Confocal, pinhole pequeño | 0.37 × longitud de onda ÷ AN lateral; 0.64 × longitud de onda ÷ (n − √(n² − AN²)) axial | FWHM con el pinhole por debajo de 0.25 unidades Airy (Zeiss) |
La longitud de onda es la de emisión para la fluorescencia de campo amplio y un promedio de excitación y emisión para la confocal; AN es la apertura numérica del objetivo y n el índice de refracción del medio de inmersión. El aumento no aparece en ninguna parte: decide qué tan grande se ve el detalle, no si se resuelve. Estos son los mejores casos teóricos; un condensador desalineado, el bajo contraste, las muestras gruesas y la discrepancia de índice de refracción empeoran la resolución real.
Ejemplo resuelto: emisión de 520 nm y un objetivo de inmersión en aceite de AN 1.4: Rayleigh 0.61 × 520 ÷ 1.4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2.8 = 186 nm; axial aproximadamente 2 × 520 × 1.518 ÷ 1.96 = 805 nm.
Muestreo de Nyquist: qué tan pequeños deben ser tus píxeles
Para registrar el detalle que resuelve la óptica, el tamaño de píxel en la muestra debe ser como máximo la mitad del período resuelto más pequeño. La referencia de Nyquist de SVI da la distancia crítica de muestreo como longitud de onda de emisión ÷ (4 × AN) para campo amplio y longitud de onda de excitación ÷ (8 × AN) para confocal; muchas unidades simplemente dividen la resolución entre 2.3 como margen de seguridad. Los píxeles más grandes pierden detalle para siempre (submuestreo); los mucho más pequeños solo cuestan luz, tiempo y espacio en disco, salvo que pienses hacer deconvolución.
Comprueba tu tamaño de píxel real con la calculadora de tamaño de píxel: un píxel de cámara de 6.5 µm detrás de un objetivo de 60× equivale a 108 nm en la muestra, lo que muestrea luz de 520 nm con AN 1.4 (Nyquist 93 nm) de forma ligeramente gruesa.
Apertura numérica
AN = n × sen(semiángulo)
El semiángulo es la mitad del ángulo de apertura del cono de luz que acepta el objetivo, y n el índice de refracción entre el cubreobjetos y la lente frontal. En aire la AN no puede llegar a 1; los objetivos secos reales se quedan en unos 0.95. La inmersión en agua llega a unos 1.27, el aceite de silicona a unos 1.35 y la inmersión en aceite a entre 1.4 y 1.49 aproximadamente. La AN de un objetivo va grabada después de su aumento, por ejemplo "60×/1.40 Oil".
Profundidad de campo (MicroscopyU): d = longitud de onda × n ÷ AN² + n × e ÷ (M × AN), donde e es la distancia mínima que resuelve el detector (aproximadamente un píxel de la cámara) y M el aumento del objetivo. Los objetivos de AN alta tienen una profundidad de campo muy reducida, por eso un corte grueso necesita una pila Z.
Preguntas
¿Cuál es la resolución de un microscopio óptico?
Unos 200–250 nm en el plano lateral con un objetivo de inmersión en aceite de AN alta y luz visible (0.61 × 520 nm ÷ 1.4 ≈ 227 nm según el criterio de Rayleigh), y aproximadamente 500–800 nm a lo largo del eje óptico.
¿Cuál es la diferencia entre los límites de Abbe y de Rayleigh?
Abbe (longitud de onda ÷ 2AN) es la estructura periódica más fina que transmite un objetivo; Rayleigh (0.61 × longitud de onda ÷ AN) es la distancia a la que dos fuentes puntuales apenas se pueden distinguir. Ambos escalan con longitud de onda ÷ AN; Rayleigh es el valor más conservador.
¿Cómo se calcula la apertura numérica?
AN = n × sen(semiángulo), donde n es el índice de refracción del medio de inmersión y el semiángulo es la mitad del ángulo de apertura del cono de luz. Un objetivo seco que acepta un semiángulo de 64° tiene AN = sen 64° ≈ 0.90.
¿Qué tamaño de píxel necesito para el muestreo de Nyquist?
Como máximo longitud de onda ÷ (4 × AN) en la muestra para campo amplio (longitud de onda de emisión), y longitud de onda ÷ (8 × AN) para confocal (longitud de onda de excitación). Para 520 nm y AN 1.4 eso da unos 93 nm (campo amplio) o 46 nm (confocal).
¿Un mayor aumento da mejor resolución?
No. La resolución la fijan la AN y la longitud de onda. Un mayor aumento sin mayor AN agranda el mismo borrón ("aumento vacío").
¿Esta calculadora es gratuita?
Sí. Funciona en tu navegador y no envía nada a ninguna parte. SlideScope, la aplicación de microscopía de escritorio creada por el mismo equipo, es una aplicación de pago con una biblioteca de muestras gratuita (con todas las herramientas) y una suscripción para tus propias imágenes.
Fuentes
- Nikon MicroscopyU — Resolución
- Nikon MicroscopyU — Depth of field and depth of focus
- ZEISS — Basics of confocal laser scanning microscopy (Wilhelm)
- SVI Huygens — The Nyquist rate
Los resultados son teóricos o aritméticos; compáralos con la documentación de tu instrumento antes de confiar en ellos para trabajo clínico o regulado.
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