Ótica
Calculadora de resolução e abertura numérica do microscópio
Introduza o comprimento de onda e a abertura numérica da objetiva para ver o detalhe mais fino que consegue separar, lateralmente e ao longo do eixo ótico, em imagiologia de campo largo e confocal, e quão pequenos têm de ser os seus píxeis para o captar (Nyquist). Mais abaixo: a abertura numérica a partir do ângulo de aceitação e a profundidade de campo.
Fórmulas de resolução e quando se aplica cada uma
| Limite | Fórmula | Use para |
|---|---|---|
| Abbe | d = comprimento de onda ÷ (2 × NA) | O detalhe periódico mais fino que a objetiva transmite |
| Rayleigh | r = 0,61 × comprimento de onda ÷ NA | Duas fontes pontuais, com objetiva e condensador iguais (ou fluorescência) |
| Campo claro com condensador | r = 1,22 × comprimento de onda ÷ (NAobj + NAcond) | Luz transmitida quando a NA do condensador é inferior à da objetiva |
| Axial, campo largo | z ≈ 2 × comprimento de onda × n ÷ NA² | A espessura do corte ótico que uma imagem de campo largo consegue separar |
| Confocal, pinhole pequeno | 0,37 × comprimento de onda ÷ NA lateral; 0,64 × comprimento de onda ÷ (n − √(n² − NA²)) axial | FWHM com o pinhole abaixo de 0,25 unidades de Airy (Zeiss) |
O comprimento de onda é o de emissão em fluorescência de campo largo e uma média dos de excitação e emissão em confocal; NA é a abertura numérica da objetiva e n o índice de refração do meio de imersão. A ampliação não aparece em lado nenhum: decide o tamanho com que o detalhe é visto, não se é resolvido. Estes são os melhores casos teóricos; um condensador desalinhado, pouco contraste, amostras espessas e diferenças de índice de refração pioram a resolução real.
Exemplo prático: emissão a 520 nm e uma objetiva de imersão em óleo de NA 1,4: Rayleigh 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2,8 = 186 nm; axial cerca de 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 nm.
Amostragem de Nyquist: quão pequenos têm de ser os seus píxeis
Para registar o detalhe que a ótica resolve, o tamanho de píxel na amostra tem de ser, no máximo, metade do menor período resolvido. A referência de Nyquist da SVI indica como distância crítica de amostragem comprimento de onda de emissão ÷ (4 × NA) em campo largo e comprimento de onda de excitação ÷ (8 × NA) em confocal; muitas plataformas de microscopia limitam-se a dividir a resolução por 2,3 como margem de segurança. Píxeis maiores perdem detalhe de forma irrecuperável (subamostragem); píxeis muito mais pequenos só custam luz, tempo e espaço em disco, a menos que tencione fazer desconvolução.
Verifique o seu tamanho de píxel real com a calculadora do tamanho de píxel: um píxel de câmara de 6,5 µm atrás de uma objetiva de 60× corresponde a 108 nm na amostra, o que amostra luz de 520 nm com NA 1,4 (Nyquist 93 nm) de forma ligeiramente grosseira.
Abertura numérica
NA = n × sen(semiângulo)
O semiângulo é metade do ângulo de abertura do cone de luz que a objetiva aceita, e n o índice de refração entre a lamela e a lente frontal. No ar, a NA não pode chegar a 1; as objetivas secas reais ficam por cerca de 0,95. A imersão em água chega a cerca de 1,27, o óleo de silicone a cerca de 1,35 e a imersão em óleo a cerca de 1,4 a 1,49. A NA de uma objetiva está gravada a seguir à ampliação, por exemplo "60×/1.40 Oil".
Profundidade de campo (MicroscopyU): d = comprimento de onda × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), em que e é a menor distância que o detetor resolve (cerca de um píxel da câmara) e M a ampliação da objetiva. As objetivas de NA elevada têm uma profundidade de campo muito reduzida, e é por isso que um corte espesso precisa de uma pilha Z.
Perguntas
Qual é a resolução de um microscópio ótico?
Cerca de 200–250 nm lateralmente com uma objetiva de imersão em óleo de NA elevada e luz visível (0,61 × 520 nm ÷ 1,4 ≈ 227 nm pelo critério de Rayleigh) e aproximadamente 500–800 nm ao longo do eixo ótico.
Qual é a diferença entre os limites de Abbe e de Rayleigh?
O limite de Abbe (comprimento de onda ÷ 2NA) é a estrutura periódica mais fina que uma objetiva transmite; o de Rayleigh (0,61 × comprimento de onda ÷ NA) é a distância a que duas fontes pontuais ainda se conseguem distinguir. Ambos variam com comprimento de onda ÷ NA; o de Rayleigh é o valor mais conservador.
Como se calcula a abertura numérica?
NA = n × sen(semiângulo), em que n é o índice de refração do meio de imersão e o semiângulo é metade do ângulo de abertura do cone de luz. Uma objetiva seca que aceita um semiângulo de 64° tem NA = sen 64° ≈ 0,90.
De que tamanho de píxel preciso para a amostragem de Nyquist?
No máximo comprimento de onda ÷ (4 × NA) na amostra em campo largo (comprimento de onda de emissão) e comprimento de onda ÷ (8 × NA) em confocal (comprimento de onda de excitação). Para 520 nm e NA 1,4, isso dá cerca de 93 nm (campo largo) ou 46 nm (confocal).
Uma ampliação maior dá melhor resolução?
Não. A resolução é determinada pela NA e pelo comprimento de onda. Uma ampliação maior sem uma NA maior apenas amplia a mesma desfocagem ("ampliação vazia").
Esta calculadora é gratuita?
Sim. Funciona no seu navegador e não envia nada para lado nenhum. O SlideScope, a aplicação de microscopia para computador da mesma equipa, é uma aplicação paga com uma biblioteca de amostras gratuita (todas as ferramentas) e uma subscrição para as suas próprias imagens.
Fontes
- Nikon MicroscopyU — Resolução
- Nikon MicroscopyU — Depth of field and depth of focus
- ZEISS — Basics of confocal laser scanning microscopy (Wilhelm)
- SVI Huygens — The Nyquist rate
Os resultados são teóricos ou aritméticos; confronte-os com a documentação do seu instrumento antes de confiar neles para trabalho clínico ou regulamentado.
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