ทัศนศาสตร์
เครื่องคำนวณความละเอียดและรูรับแสงเชิงตัวเลขของกล้องจุลทรรศน์
ใส่ความยาวคลื่นและรูรับแสงเชิงตัวเลขของเลนส์ใกล้วัตถุ เพื่อดูว่าแยกรายละเอียดได้ละเอียดเพียงใด ทั้งในแนวระนาบและตามแกนออปติก สำหรับการถ่ายภาพแบบไวด์ฟิลด์และคอนโฟคอล และพิกเซลต้องเล็กเพียงใดจึงจะเก็บรายละเอียดนั้นได้ (Nyquist) ด้านล่างมีการคำนวณรูรับแสงเชิงตัวเลขจากมุมรับแสง และระยะชัดลึก
สูตรความละเอียด และกรณีที่แต่ละสูตรใช้ได้
| ขีดจำกัด | สูตร | ใช้สำหรับ |
|---|---|---|
| Abbe | d = ความยาวคลื่น ÷ (2 × NA) | รายละเอียดแบบเป็นคาบที่ละเอียดที่สุดที่เลนส์ใกล้วัตถุส่งผ่านได้ |
| Rayleigh | r = 0.61 × ความยาวคลื่น ÷ NA | แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดสองจุด โดย NA ของเลนส์ใกล้วัตถุและคอนเดนเซอร์เท่ากัน (หรือฟลูออเรสเซนซ์) |
| ไบรท์ฟิลด์พร้อมคอนเดนเซอร์ | r = 1.22 × ความยาวคลื่น ÷ (NAobj + NAcond) | แสงส่องผ่าน เมื่อ NA ของคอนเดนเซอร์ต่ำกว่าของเลนส์ใกล้วัตถุ |
| แนวแกน, ไวด์ฟิลด์ | z ≈ 2 × ความยาวคลื่น × n ÷ NA² | ภาพไวด์ฟิลด์แยกชั้นความหนาได้บางเพียงใด |
| คอนโฟคอล, pinhole ขนาดเล็ก | แนวระนาบ 0.37 × ความยาวคลื่น ÷ NA; แนวแกน 0.64 × ความยาวคลื่น ÷ (n − √(n² − NA²)) | FWHM เมื่อ pinhole เล็กกว่า 0.25 Airy unit (Zeiss) |
ความยาวคลื่นหมายถึงความยาวคลื่นการเปล่งแสงสำหรับฟลูออเรสเซนซ์แบบไวด์ฟิลด์ และค่าเฉลี่ยของความยาวคลื่นการกระตุ้นและการเปล่งแสงสำหรับคอนโฟคอล NA คือรูรับแสงเชิงตัวเลขของเลนส์ใกล้วัตถุ และ n คือดัชนีหักเหของตัวกลางแช่เลนส์ กำลังขยายไม่ปรากฏในสูตรใดเลย: กำลังขยายกำหนดว่ารายละเอียดดูใหญ่เพียงใด ไม่ได้กำหนดว่าแยกรายละเอียดได้หรือไม่ ค่าเหล่านี้เป็นกรณีที่ดีที่สุดตามทฤษฎี คอนเดนเซอร์ที่ปรับแนวไม่ตรง คอนทราสต์ต่ำ ตัวอย่างที่หนา และดัชนีหักเหที่ไม่เข้ากัน ล้วนทำให้ความละเอียดจริงแย่ลง
ตัวอย่างการคำนวณ: การเปล่งแสง 520 nm กับเลนส์ใกล้วัตถุแบบน้ำมัน NA 1.4: Rayleigh 0.61 × 520 ÷ 1.4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2.8 = 186 nm; แนวแกนประมาณ 2 × 520 × 1.518 ÷ 1.96 = 805 nm
การสุ่มตัวอย่างตาม Nyquist: พิกเซลต้องเล็กเพียงใด
เพื่อบันทึกรายละเอียดที่ระบบออปติกแยกได้ ขนาดพิกเซลที่ตัวอย่างต้องไม่เกินครึ่งหนึ่งของคาบที่เล็กที่สุดที่แยกได้ เอกสารอ้างอิงเรื่อง Nyquist ของ SVI ระบุระยะสุ่มตัวอย่างวิกฤตเป็น ความยาวคลื่นการเปล่งแสง ÷ (4 × NA) สำหรับไวด์ฟิลด์ และ ความยาวคลื่นการกระตุ้น ÷ (8 × NA) สำหรับคอนโฟคอล หลายศูนย์บริการเครื่องมือเพียงหารความละเอียดด้วย 2.3 เพื่อเผื่อความปลอดภัย พิกเซลที่ใหญ่กว่านี้จะสูญเสียรายละเอียดไปอย่างถาวร (การสุ่มตัวอย่างไม่พอ) ส่วนพิกเซลที่เล็กกว่ามากจะเปลืองแสง เวลา และพื้นที่ดิสก์เท่านั้น เว้นแต่คุณวางแผนจะทำดีคอนโวลูชัน
ตรวจสอบขนาดพิกเซลจริงของคุณด้วยเครื่องคำนวณขนาดพิกเซล: พิกเซลกล้อง 6.5 µm หลังเลนส์ใกล้วัตถุ 60× เท่ากับ 108 nm ที่ตัวอย่าง ซึ่งสุ่มตัวอย่างแสง 520 nm ที่ NA 1.4 (Nyquist 93 nm) หยาบไปเล็กน้อย
รูรับแสงเชิงตัวเลข (NA)
NA = n × sin(มุมครึ่ง)
มุมครึ่งคือครึ่งหนึ่งของมุมเปิดของกรวยแสงที่เลนส์ใกล้วัตถุรับได้ และ n คือดัชนีหักเหระหว่างกระจกปิดสไลด์กับเลนส์หน้า ในอากาศ NA ไม่สามารถถึง 1 ได้ เลนส์ใกล้วัตถุแบบแห้งจริงหยุดอยู่ที่ประมาณ 0.95 เลนส์แช่น้ำได้ถึงประมาณ 1.27 น้ำมันซิลิโคนประมาณ 1.35 และเลนส์แช่น้ำมันประมาณ 1.4 ถึง 1.49 ค่า NA ของเลนส์ใกล้วัตถุสลักไว้ต่อจากกำลังขยาย เช่น "60×/1.40 Oil"
ระยะชัดลึก (MicroscopyU): d = ความยาวคลื่น × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA) โดย e คือระยะเล็กที่สุดที่ตัวตรวจจับแยกได้ (ประมาณหนึ่งพิกเซลของกล้อง) และ M คือกำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุ เลนส์ใกล้วัตถุที่มี NA สูงมีระยะชัดลึกตื้นมาก จึงเป็นเหตุผลที่ชิ้นเนื้อหนาต้องใช้ Z-stack
คำถาม
กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงมีความละเอียดเท่าใด?
ประมาณ 200–250 nm ในแนวระนาบ เมื่อใช้เลนส์ใกล้วัตถุแบบน้ำมันที่มี NA สูงกับแสงที่ตามองเห็น (0.61 × 520 nm ÷ 1.4 ≈ 227 nm ตามเกณฑ์ Rayleigh) และประมาณ 500–800 nm ตามแกนออปติก
ขีดจำกัดของ Abbe และ Rayleigh ต่างกันอย่างไร?
Abbe (ความยาวคลื่น ÷ 2NA) คือโครงสร้างแบบเป็นคาบที่ละเอียดที่สุดที่เลนส์ใกล้วัตถุส่งผ่านได้ ส่วน Rayleigh (0.61 × ความยาวคลื่น ÷ NA) คือระยะที่แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดสองจุดเพิ่งจะแยกออกจากกันได้ ทั้งสองค่าแปรตามความยาวคลื่น ÷ NA โดย Rayleigh เป็นค่าที่อนุรักษ์นิยมกว่า
คำนวณรูรับแสงเชิงตัวเลขได้อย่างไร?
NA = n × sin(มุมครึ่ง) โดย n คือดัชนีหักเหของตัวกลางแช่เลนส์ และมุมครึ่งคือครึ่งหนึ่งของมุมเปิดของกรวยแสง เลนส์ใกล้วัตถุแบบแห้งที่รับแสงด้วยมุมครึ่ง 64° มี NA = sin 64° ≈ 0.90
ต้องใช้ขนาดพิกเซลเท่าใดสำหรับการสุ่มตัวอย่างตาม Nyquist?
ไม่เกินความยาวคลื่น ÷ (4 × NA) ที่ชิ้นตัวอย่างสำหรับไวด์ฟิลด์ (ความยาวคลื่นการเปล่งแสง) และความยาวคลื่น ÷ (8 × NA) สำหรับคอนโฟคอล (ความยาวคลื่นการกระตุ้น) สำหรับ 520 nm และ NA 1.4 จะได้ประมาณ 93 nm (ไวด์ฟิลด์) หรือ 46 nm (คอนโฟคอล)
กำลังขยายที่สูงขึ้นให้ความละเอียดที่ดีขึ้นหรือไม่?
ไม่ ความละเอียดถูกกำหนดโดย NA และความยาวคลื่น กำลังขยายที่สูงขึ้นโดยไม่เพิ่ม NA เป็นเพียงการขยายความพร่ามัวเดิมให้ใหญ่ขึ้น ("กำลังขยายเปล่า")
เครื่องคำนวณนี้ใช้ฟรีหรือไม่?
ใช่ เครื่องคำนวณทำงานในเบราว์เซอร์ของคุณและไม่ส่งข้อมูลใด ๆ ออกไป ส่วน SlideScope แอปกล้องจุลทรรศน์บนเดสก์ท็อปจากทีมเดียวกัน เป็นแอปแบบชำระเงินที่มีคลังภาพตัวอย่างฟรี (ใช้ได้ทุกเครื่องมือ) และต้องสมัครสมาชิกสำหรับภาพของคุณเอง
แหล่งอ้างอิง
- Nikon MicroscopyU — ความละเอียด
- Nikon MicroscopyU — ระยะชัดลึกและความลึกของโฟกัส
- ZEISS — พื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบสแกนด้วยเลเซอร์ (Wilhelm)
- SVI Huygens — อัตรา Nyquist
ผลลัพธ์เป็นค่าทางทฤษฎีหรือการคำนวณทางคณิตศาสตร์ ตรวจสอบกับเอกสารของเครื่องมือของคุณก่อนนำไปใช้กับงานทางคลินิกหรืองานที่มีการกำกับดูแล
วัดบนภาพจริงของคุณ
SlideScope เปิดไฟล์จากกล้องจุลทรรศน์และเครื่องสแกนสไลด์ได้ 34 รูปแบบ รวมถึง CZI, ND2, SVS และ LIF พร้อมการปรับเทียบของไฟล์เอง ความยาว พื้นที่ จำนวนเซลล์ และแถบมาตราส่วนจึงออกมาเป็น µm โดยไม่ต้องตั้งค่าใด ๆ ลองใช้ทุกเครื่องมือฟรีกับภาพตัวอย่างในตัว ส่วนการเปิดภาพของคุณเองต้องใช้การสมัครสมาชิก ตัดสินใจแล้ว? สมัครสมาชิกเลย