Optik
Kalkulator resolusi dan apertur numerik mikroskop
Masukkan panjang gelombang dan apertur numerik objektif untuk melihat seberapa halus detail yang dapat dipisahkannya, secara lateral maupun sepanjang sumbu optik, untuk pencitraan widefield dan konfokal, serta seberapa kecil piksel Anda harus berukuran agar dapat menangkapnya (Nyquist). Di bawahnya: apertur numerik dari sudut penerimaan, dan kedalaman bidang (depth of field).
Rumus resolusi, dan kapan masing-masing berlaku
| Batas | Rumus | Gunakan untuk |
|---|---|---|
| Abbe | d = panjang gelombang ÷ (2 × NA) | Detail periodik terhalus yang dapat diteruskan objektif |
| Rayleigh | r = 0,61 × panjang gelombang ÷ NA | Dua sumber titik, objektif dan kondensor disamakan (atau fluoresens) |
| Brightfield dengan kondensor | r = 1,22 × panjang gelombang ÷ (NAobj + NAcond) | Cahaya transmisi bila NA kondensor lebih rendah daripada NA objektif |
| Aksial, widefield | z ≈ 2 × panjang gelombang × n ÷ NA² | Seberapa tipis irisan yang dapat dipisahkan citra widefield |
| Konfokal, pinhole kecil | 0,37 × panjang gelombang ÷ NA lateral; 0,64 × panjang gelombang ÷ (n − √(n² − NA²)) aksial | FWHM dengan pinhole di bawah 0,25 satuan Airy (Zeiss) |
Panjang gelombang berarti panjang gelombang emisi untuk fluoresens widefield dan rata-rata eksitasi dan emisi untuk konfokal; NA adalah apertur numerik objektif dan n adalah indeks bias medium imersi. Perbesaran sama sekali tidak muncul: perbesaran menentukan seberapa besar detail terlihat, bukan apakah detail itu terpisahkan. Ini adalah kondisi terbaik secara teoretis; kondensor yang tidak sejajar, kontras rendah, sampel tebal, dan ketidakcocokan indeks bias semuanya membuat resolusi nyata menjadi lebih buruk.
Contoh perhitungan: emisi 520 nm dan objektif minyak NA 1,4: Rayleigh 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2,8 = 186 nm; aksial sekitar 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 nm.
Pencuplikan Nyquist: seberapa kecil piksel Anda harus berukuran
Untuk merekam detail yang dapat dipisahkan oleh optik, ukuran piksel pada sampel paling besar setengah dari periode terkecil yang terpisahkan. Referensi Nyquist dari SVI memberikan jarak pencuplikan kritis sebesar panjang gelombang emisi ÷ (4 × NA) untuk widefield dan panjang gelombang eksitasi ÷ (8 × NA) untuk konfokal; banyak fasilitas cukup membagi resolusi dengan 2,3 sebagai margin keamanan. Piksel yang lebih besar kehilangan detail secara permanen (undersampling); piksel yang jauh lebih kecil hanya menghabiskan cahaya, waktu, dan ruang disk, kecuali Anda berencana melakukan dekonvolusi.
Periksa ukuran piksel Anda yang sebenarnya dengan kalkulator ukuran piksel: piksel kamera 6,5 µm di belakang objektif 60× bernilai 108 nm pada sampel, yang mencuplik cahaya 520 nm pada NA 1,4 (Nyquist 93 nm) sedikit terlalu kasar.
Apertur numerik
NA = n × sin(setengah sudut)
Setengah sudut adalah separuh dari sudut bukaan kerucut cahaya yang diterima objektif, dan n adalah indeks bias antara kaca penutup dan lensa depan. Di udara, NA tidak dapat mencapai 1; objektif kering yang nyata berhenti di sekitar 0,95. Imersi air mencapai sekitar 1,27, minyak silikon sekitar 1,35, dan imersi minyak sekitar 1,4 hingga 1,49. NA sebuah objektif terukir setelah perbesarannya, misalnya "60×/1.40 Oil".
Kedalaman bidang (MicroscopyU): d = panjang gelombang × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), dengan e adalah jarak terkecil yang dapat dipisahkan detektor (sekitar satu piksel kamera) dan M adalah perbesaran objektif. Objektif ber-NA tinggi memiliki kedalaman bidang yang sangat dangkal, itulah sebabnya potongan yang tebal memerlukan Z-stack.
Pertanyaan
Berapa resolusi mikroskop cahaya?
Sekitar 200–250 nm secara lateral dengan objektif minyak ber-NA tinggi dalam cahaya tampak (0,61 × 520 nm ÷ 1,4 ≈ 227 nm menurut kriteria Rayleigh), dan kira-kira 500–800 nm sepanjang sumbu optik.
Apa perbedaan antara batas Abbe dan Rayleigh?
Abbe (panjang gelombang ÷ 2NA) adalah struktur periodik terhalus yang dapat diteruskan sebuah objektif; Rayleigh (0,61 × panjang gelombang ÷ NA) adalah jarak ketika dua sumber titik masih dapat dibedakan. Keduanya berbanding lurus dengan panjang gelombang ÷ NA; Rayleigh adalah angka yang lebih konservatif.
Bagaimana cara menghitung apertur numerik?
NA = n × sin(setengah sudut), dengan n adalah indeks bias medium imersi dan setengah sudut adalah separuh dari sudut bukaan kerucut cahaya. Objektif kering yang menerima setengah sudut 64° memiliki NA = sin 64° ≈ 0,90.
Berapa ukuran piksel yang saya perlukan untuk pencuplikan Nyquist?
Paling besar panjang gelombang ÷ (4 × NA) pada spesimen untuk widefield (panjang gelombang emisi), dan panjang gelombang ÷ (8 × NA) untuk konfokal (panjang gelombang eksitasi). Untuk 520 nm dan NA 1,4, nilainya sekitar 93 nm (widefield) atau 46 nm (konfokal).
Apakah perbesaran yang lebih tinggi memberikan resolusi yang lebih baik?
Tidak. Resolusi ditentukan oleh NA dan panjang gelombang. Perbesaran yang lebih tinggi tanpa NA yang lebih tinggi hanya memperbesar keburaman yang sama ("perbesaran kosong").
Apakah kalkulator ini gratis?
Ya. Kalkulator ini berjalan di browser Anda dan tidak mengirim apa pun ke mana pun. SlideScope, aplikasi mikroskopi desktop buatan tim yang sama, adalah aplikasi berbayar dengan pustaka sampel gratis (semua alat) dan langganan untuk citra Anda sendiri.
Sumber
- Nikon MicroscopyU — Resolution
- Nikon MicroscopyU — Kedalaman bidang dan kedalaman fokus
- ZEISS — Dasar-dasar mikroskopi pemindaian laser konfokal (Wilhelm)
- SVI Huygens — Laju Nyquist
Hasilnya bersifat teoretis atau aritmetis; periksa terhadap dokumentasi instrumen Anda sebelum mengandalkannya untuk pekerjaan klinis atau yang diatur regulasi.
Ukur pada citra Anda yang sebenarnya
SlideScope membuka 34 format mikroskop dan pemindai slide, di antaranya CZI, ND2, SVS, dan LIF, dengan kalibrasinya sendiri, sehingga panjang, luas, jumlah sel, dan skala batang langsung keluar dalam µm tanpa pengaturan apa pun. Coba semua alat secara gratis pada sampel bawaan; membuka citra Anda sendiri memerlukan langganan. Sudah memutuskan? Berlangganan sekarang.