Óptica
Calculadora de resolución y apertura numérica del microscopio
Introduce la longitud de onda y la apertura numérica del objetivo para ver qué detalle tan fino puede separar, en lateral y a lo largo del eje óptico, en imagen de campo amplio y confocal, y lo pequeños que deben ser tus píxeles para captarlo (Nyquist). Más abajo: apertura numérica a partir del ángulo de aceptación y profundidad de campo.
Fórmulas de resolución y cuándo se aplica cada una
| Límite | Fórmula | Úsalo para |
|---|---|---|
| Abbe | d = longitud de onda ÷ (2 × AN) | El detalle periódico más fino que deja pasar el objetivo |
| Rayleigh | r = 0,61 × longitud de onda ÷ AN | Dos fuentes puntuales, con objetivo y condensador iguales (o fluorescencia) |
| Campo claro con condensador | r = 1,22 × longitud de onda ÷ (ANobj + ANcond) | Luz transmitida cuando la AN del condensador es menor que la del objetivo |
| Axial, campo amplio | z ≈ 2 × longitud de onda × n ÷ AN² | Lo fino que es el corte que separa una imagen de campo amplio |
| Confocal, pinhole pequeño | 0,37 × longitud de onda ÷ AN lateral; 0,64 × longitud de onda ÷ (n − √(n² − AN²)) axial | FWHM con el pinhole por debajo de 0,25 unidades de Airy (Zeiss) |
La longitud de onda es la de emisión en fluorescencia de campo amplio y una media de excitación y emisión en confocal; AN es la apertura numérica del objetivo y n el índice de refracción del medio de inmersión. El aumento no aparece en ninguna parte: decide lo grande que se ve el detalle, no si se resuelve. Son los mejores casos teóricos; un condensador mal alineado, el bajo contraste, las muestras gruesas y el desajuste del índice de refracción empeoran la resolución real.
Ejemplo práctico: emisión a 520 nm y un objetivo de aceite de AN 1,4: Rayleigh 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2,8 = 186 nm; axial, aproximadamente 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 nm.
Muestreo de Nyquist: lo pequeños que deben ser tus píxeles
Para registrar el detalle que resuelve la óptica, el tamaño de píxel en la muestra debe ser como máximo la mitad del periodo resuelto más pequeño. La referencia de Nyquist de SVI da como distancia crítica de muestreo longitud de onda de emisión ÷ (4 × AN) en campo amplio y longitud de onda de excitación ÷ (8 × AN) en confocal; muchas plataformas simplemente dividen la resolución entre 2,3 como margen de seguridad. Con píxeles más grandes se pierde detalle de forma irreversible (submuestreo); con píxeles mucho más pequeños solo se gasta luz, tiempo y espacio en disco, salvo que pienses hacer deconvolución.
Comprueba tu tamaño de píxel real con la calculadora del tamaño de píxel: un píxel de cámara de 6,5 µm tras un objetivo de 60× equivale a 108 nm en la muestra, lo que muestrea luz de 520 nm con AN 1,4 (Nyquist 93 nm) de forma algo gruesa.
Apertura numérica
AN = n × sen(semiángulo)
El semiángulo es la mitad del ángulo de apertura del cono de luz que acepta el objetivo, y n el índice de refracción entre el cubreobjetos y la lente frontal. En aire, la AN no puede llegar a 1; los objetivos secos reales se quedan en torno a 0,95. La inmersión en agua llega a unos 1,27, el aceite de silicona a unos 1,35 y la inmersión en aceite a entre 1,4 y 1,49. La AN de un objetivo va grabada tras su aumento, por ejemplo "60×/1.40 Oil".
Profundidad de campo (MicroscopyU): d = longitud de onda × n ÷ AN² + n × e ÷ (M × AN), donde e es la distancia más pequeña que resuelve el detector (aproximadamente un píxel de la cámara) y M el aumento del objetivo. Los objetivos de AN alta tienen una profundidad de campo muy reducida, por eso una sección gruesa necesita una pila Z.
Preguntas
¿Cuál es la resolución de un microscopio óptico?
Unos 200–250 nm en lateral con un objetivo de aceite de AN alta en luz visible (0,61 × 520 nm ÷ 1,4 ≈ 227 nm según el criterio de Rayleigh), y aproximadamente 500–800 nm a lo largo del eje óptico.
¿Qué diferencia hay entre el límite de Abbe y el de Rayleigh?
Abbe (longitud de onda ÷ 2AN) es la estructura periódica más fina que transmite un objetivo; Rayleigh (0,61 × longitud de onda ÷ AN) es la distancia a la que dos fuentes puntuales apenas se pueden distinguir. Ambos dependen de longitud de onda ÷ AN; Rayleigh es el valor más conservador.
¿Cómo se calcula la apertura numérica?
AN = n × sen(semiángulo), donde n es el índice de refracción del medio de inmersión y el semiángulo es la mitad del ángulo de apertura del cono de luz. Un objetivo seco que acepta un semiángulo de 64° tiene AN = sen 64° ≈ 0,90.
¿Qué tamaño de píxel necesito para el muestreo de Nyquist?
Como máximo longitud de onda ÷ (4 × AN) en la muestra para campo amplio (longitud de onda de emisión) y longitud de onda ÷ (8 × AN) para confocal (longitud de onda de excitación). Para 520 nm y AN 1,4 son unos 93 nm (campo amplio) o 46 nm (confocal).
¿Más aumento da mejor resolución?
No. La resolución la fijan la AN y la longitud de onda. Más aumento sin más AN agranda el mismo desenfoque ("aumento vacío").
¿Esta calculadora es gratuita?
Sí. Funciona en tu navegador y no envía nada a ninguna parte. SlideScope, la aplicación de microscopía de escritorio creada por el mismo equipo, es una aplicación de pago con una biblioteca de muestras gratuita (todas las herramientas) y una suscripción para tus propias imágenes.
Fuentes
- Nikon MicroscopyU — Resolución
- Nikon MicroscopyU — Profundidad de campo y profundidad de foco
- ZEISS — Fundamentos de la microscopía confocal de barrido láser (Wilhelm)
- SVI Huygens — La frecuencia de Nyquist
Los resultados son teóricos o aritméticos; compruébalos con la documentación de tu instrumento antes de basarte en ellos para trabajo clínico o regulado.
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