분해능 공식과 각각이 적용되는 경우
| 한계 | 공식 | 용도 |
|---|---|---|
| Abbe | d = 파장 ÷ (2 × NA) | 대물렌즈가 통과시키는 가장 미세한 주기적 디테일 |
| Rayleigh | r = 0.61 × 파장 ÷ NA | 두 점광원, 대물렌즈와 콘덴서 NA가 같을 때(또는 형광) |
| 콘덴서를 사용하는 명시야 | r = 1.22 × 파장 ÷ (NAobj + NAcond) | 콘덴서 NA가 대물렌즈보다 낮은 투과광 |
| 축 방향, 광시야 | z ≈ 2 × 파장 × n ÷ NA² | 광시야 이미지가 얼마나 얇은 단면을 구분하는지 |
| 공초점, 작은 핀홀 | 측면 0.37 × 파장 ÷ NA, 축 방향 0.64 × 파장 ÷ (n − √(n² − NA²)) | 핀홀이 0.25 Airy 단위 미만일 때의 FWHM(Zeiss) |
파장은 광시야 형광에서는 방출 파장을, 공초점에서는 여기 파장과 방출 파장의 평균을 뜻합니다. NA는 대물렌즈의 개구수, n은 침지 매질의 굴절률입니다. 배율은 어디에도 나오지 않습니다. 배율은 디테일이 얼마나 크게 보이는지를 결정할 뿐, 분해되는지 여부를 결정하지 않습니다. 이 값들은 이론상 최상의 경우이며, 정렬되지 않은 콘덴서, 낮은 대비, 두꺼운 시료, 굴절률 불일치는 모두 실제 분해능을 떨어뜨립니다.
계산 예: 520 nm 방출과 1.4 NA 오일 대물렌즈: Rayleigh 0.61 × 520 ÷ 1.4 = 227 nm, Abbe 520 ÷ 2.8 = 186 nm, 축 방향 약 2 × 520 × 1.518 ÷ 1.96 = 805 nm.
Nyquist 샘플링: 픽셀은 얼마나 작아야 하는가
광학계가 분해하는 디테일을 기록하려면 시료 기준 픽셀 크기가 분해되는 최소 주기의 절반 이하여야 합니다. SVI의 Nyquist 참고 자료는 임계 샘플링 거리를 광시야에서는 방출 파장 ÷ (4 × NA), 공초점에서는 여기 파장 ÷ (8 × NA)로 제시하며, 많은 시설에서는 안전 여유를 두기 위해 분해능을 단순히 2.3으로 나눕니다. 픽셀이 더 크면 디테일이 영구히 손실되고(언더샘플링), 훨씬 더 작으면 디컨볼루션을 할 계획이 아닌 한 빛, 시간, 디스크 공간만 낭비합니다.
픽셀 크기 계산기로 실제 픽셀 크기를 확인하세요. 60× 대물렌즈 뒤의 6.5 µm 카메라 픽셀은 시료 기준 108 nm이며, 이는 1.4 NA에서 520 nm 빛(Nyquist 93 nm)을 약간 거칠게 샘플링하는 셈입니다.
개구수
NA = n × sin(반각)
반각은 대물렌즈가 받아들이는 광원뿔의 열림각의 절반이고, n은 커버슬립과 전면 렌즈 사이의 굴절률입니다. 공기 중에서는 NA가 1에 도달할 수 없으며, 실제 건식 대물렌즈는 약 0.95가 한계입니다. 물 침지는 약 1.27, 실리콘 오일은 약 1.35, 오일 침지는 약 1.4에서 1.49까지 도달합니다. 대물렌즈의 NA는 배율 뒤에 각인되어 있습니다(예: "60×/1.40 Oil").
피사계 심도(MicroscopyU): d = 파장 × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA). 여기서 e는 검출기가 분해하는 최소 거리(대략 카메라 픽셀 하나), M은 대물렌즈 배율입니다. 고NA 대물렌즈는 피사계 심도가 매우 얕기 때문에 두꺼운 절편에는 Z-스택이 필요합니다.
질문
광학 현미경의 분해능은 얼마인가요?
가시광에서 고NA 오일 대물렌즈를 쓰면 측면으로 약 200–250 nm(Rayleigh 기준 0.61 × 520 nm ÷ 1.4 ≈ 227 nm), 광축 방향으로 대략 500–800 nm입니다.
Abbe 한계와 Rayleigh 한계는 어떻게 다른가요?
Abbe(파장 ÷ 2NA)는 대물렌즈가 전달하는 가장 미세한 주기적 구조이고, Rayleigh(0.61 × 파장 ÷ NA)는 두 점광원을 겨우 구별할 수 있는 거리입니다. 둘 다 파장 ÷ NA에 비례하며, Rayleigh가 더 보수적인 값입니다.
개구수는 어떻게 계산하나요?
NA = n × sin(반각)이며, n은 침지 매질의 굴절률, 반각은 광원뿔 열림각의 절반입니다. 반각 64°를 받아들이는 건식 대물렌즈의 NA는 sin 64° ≈ 0.90입니다.
Nyquist 샘플링에는 어떤 픽셀 크기가 필요한가요?
시료 기준으로 광시야는 최대 파장 ÷ (4 × NA)(방출 파장), 공초점은 파장 ÷ (8 × NA)(여기 파장)입니다. 520 nm, NA 1.4라면 약 93 nm(광시야) 또는 46 nm(공초점)입니다.
배율이 높을수록 분해능이 좋아지나요?
아니요. 분해능은 NA와 파장으로 결정됩니다. NA를 높이지 않고 배율만 높이면 같은 흐림이 확대될 뿐입니다("빈 배율").
이 계산기는 무료인가요?
네. 브라우저에서 실행되며 어디에도 데이터를 보내지 않습니다. 같은 팀이 만든 데스크톱 현미경 앱 SlideScope는 무료 샘플 라이브러리(모든 도구 포함)가 있는 유료 앱이며, 내 이미지를 열려면 구독이 필요합니다.
출처
- Nikon MicroscopyU — Resolution
- Nikon MicroscopyU — Depth of field and depth of focus
- ZEISS — Basics of confocal laser scanning microscopy (Wilhelm)
- SVI Huygens — The Nyquist rate
결과는 이론값 또는 산술 계산값입니다. 임상 또는 규제 대상 업무에 사용하기 전에 장비 문서와 대조해 확인하세요.
실제 이미지에서 측정하기
SlideScope는 CZI, ND2, SVS, LIF를 포함한 34가지 현미경 및 슬라이드 스캐너 형식을 각 파일의 교정 정보와 함께 열기 때문에, 별도 설정 없이 길이, 면적, 세포 수, 스케일 바가 µm 단위로 나옵니다. 내장 샘플에서 모든 도구를 무료로 사용해 보세요. 내 이미지를 열려면 구독이 필요합니다. 이미 결정하셨나요? 지금 구독하기.