Ottica
Calcolatore di risoluzione e apertura numerica del microscopio
Inserisci la lunghezza d’onda e l’apertura numerica dell’obiettivo per vedere quanto è fine il dettaglio che riesce a separare, lateralmente e lungo l’asse ottico, in microscopia a campo largo e confocale, e quanto devono essere piccoli i pixel per catturarlo (Nyquist). Più sotto: l’apertura numerica a partire dall’angolo di accettazione e la profondità di campo.
Formule della risoluzione e quando si applica ciascuna
| Limite | Formula | Da usare per |
|---|---|---|
| Abbe | d = lunghezza d’onda ÷ (2 × NA) | Il dettaglio periodico più fine che l’obiettivo trasmette |
| Rayleigh | r = 0,61 × lunghezza d’onda ÷ NA | Due sorgenti puntiformi, obiettivo e condensatore con NA uguale (o fluorescenza) |
| Campo chiaro con condensatore | r = 1,22 × lunghezza d’onda ÷ (NAobj + NAcond) | Luce trasmessa quando la NA del condensatore è inferiore a quella dell’obiettivo |
| Assiale, campo largo | z ≈ 2 × lunghezza d’onda × n ÷ NA² | Lo spessore della sezione che un’immagine a campo largo riesce a separare |
| Confocale, pinhole piccolo | 0,37 × lunghezza d’onda ÷ NA laterale; 0,64 × lunghezza d’onda ÷ (n − √(n² − NA²)) assiale | FWHM con il pinhole sotto 0,25 unità di Airy (Zeiss) |
Per lunghezza d’onda si intende quella di emissione nella fluorescenza a campo largo e una media tra eccitazione ed emissione nella microscopia confocale; NA è l’apertura numerica dell’obiettivo e n l’indice di rifrazione del mezzo di immersione. L’ingrandimento non compare da nessuna parte: decide quanto appare grande il dettaglio, non se viene risolto. Sono i casi migliori teorici; un condensatore non allineato, un basso contrasto, campioni spessi e una discrepanza dell’indice di rifrazione peggiorano tutti la risoluzione reale.
Esempio svolto: emissione a 520 nm e obiettivo a olio con NA 1,4: Rayleigh 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2,8 = 186 nm; assiale circa 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 nm.
Campionamento di Nyquist: quanto devono essere piccoli i pixel
Per registrare i dettagli che l’ottica risolve, la dimensione del pixel sul campione deve essere al massimo la metà del più piccolo periodo risolto. Il riferimento di SVI sul criterio di Nyquist indica come distanza di campionamento critica lunghezza d’onda di emissione ÷ (4 × NA) per il campo largo e lunghezza d’onda di eccitazione ÷ (8 × NA) per il confocale; molte facility dividono semplicemente la risoluzione per 2,3 come margine di sicurezza. Pixel più grandi perdono dettagli in modo definitivo (sottocampionamento); pixel molto più piccoli costano solo luce, tempo e spazio su disco, a meno che tu non preveda una deconvoluzione.
Controlla la dimensione effettiva dei tuoi pixel con il calcolatore della dimensione del pixel: un pixel di fotocamera da 6,5 µm dietro un obiettivo 60× corrisponde a 108 nm sul campione, che campiona luce a 520 nm con NA 1,4 (Nyquist 93 nm) in modo leggermente grossolano.
Apertura numerica
NA = n × sin(semiangolo)
Il semiangolo è la metà dell’angolo di apertura del cono di luce accettato dall’obiettivo, e n è l’indice di rifrazione tra il vetrino coprioggetto e la lente frontale. In aria la NA non può raggiungere 1; gli obiettivi a secco reali si fermano a circa 0,95. L’immersione in acqua arriva a circa 1,27, l’olio di silicone a circa 1,35 e l’immersione in olio a circa 1,4–1,49. La NA di un obiettivo è incisa dopo il suo ingrandimento, per esempio "60×/1.40 Oil".
Profondità di campo (MicroscopyU): d = lunghezza d’onda × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), dove e è la distanza più piccola che il rivelatore risolve (circa un pixel della fotocamera) e M l’ingrandimento dell’obiettivo. Gli obiettivi ad alta NA hanno una profondità di campo molto ridotta, ed è per questo che una sezione spessa richiede uno Z-stack.
Domande
Qual è la risoluzione di un microscopio ottico?
Circa 200–250 nm in direzione laterale con un obiettivo a olio ad alta NA in luce visibile (0,61 × 520 nm ÷ 1,4 ≈ 227 nm secondo il criterio di Rayleigh), e circa 500–800 nm lungo l’asse ottico.
Qual è la differenza tra il limite di Abbe e quello di Rayleigh?
Abbe (lunghezza d’onda ÷ 2NA) è la struttura periodica più fine che un obiettivo trasmette; Rayleigh (0,61 × lunghezza d’onda ÷ NA) è la distanza alla quale due sorgenti puntiformi si possono appena distinguere. Entrambi scalano con lunghezza d’onda ÷ NA; Rayleigh è il valore più conservativo.
Come si calcola l’apertura numerica?
NA = n × sin(semiangolo), dove n è l’indice di rifrazione del mezzo di immersione e il semiangolo è la metà dell’angolo di apertura del cono di luce. Un obiettivo a secco che accetta un semiangolo di 64° ha NA = sin 64° ≈ 0,90.
Quale dimensione del pixel serve per il campionamento di Nyquist?
Al massimo lunghezza d’onda ÷ (4 × NA) sul campione per il campo largo (lunghezza d’onda di emissione), lunghezza d’onda ÷ (8 × NA) per il confocale (lunghezza d’onda di eccitazione). Per 520 nm e NA 1,4 sono circa 93 nm (campo largo) o 46 nm (confocale).
Un ingrandimento maggiore dà una risoluzione migliore?
No. La risoluzione dipende dalla NA e dalla lunghezza d’onda. Un ingrandimento maggiore senza una NA maggiore ingrandisce soltanto la stessa sfocatura ("ingrandimento vuoto").
Questo calcolatore è gratuito?
Sì. Funziona nel tuo browser e non invia nulla da nessuna parte. SlideScope, l’app desktop per microscopia creata dallo stesso team, è un’app a pagamento con una libreria di campioni gratuita (tutti gli strumenti) e un abbonamento per le tue immagini.
Fonti
- Nikon MicroscopyU — Risoluzione
- Nikon MicroscopyU — Profondità di campo e profondità di fuoco
- ZEISS — Fondamenti della microscopia confocale a scansione laser (Wilhelm)
- SVI Huygens — La frequenza di Nyquist
I risultati sono teorici o aritmetici; confrontali con la documentazione del tuo strumento prima di farvi affidamento per attività cliniche o regolamentate.
Misura sulle tue immagini reali
SlideScope apre 34 formati di microscopi e scanner per vetrini, tra cui CZI, ND2, SVS e LIF, con la loro calibrazione, così lunghezze, aree, conteggi di cellule e barre di scala risultano in µm senza dover impostare nulla. Prova gratis tutti gli strumenti sui campioni inclusi; per aprire le tue immagini serve un abbonamento. Hai già deciso? Abbonati ora.