Оптика
Калькулятор разрешения и числовой апертуры микроскопа
Введите длину волны и числовую апертуру объектива, чтобы узнать, какие мелкие детали он способен разделить в латеральном направлении и вдоль оптической оси при широкопольной и конфокальной съёмке, и насколько малыми должны быть пиксели, чтобы их зарегистрировать (критерий Найквиста). Ниже: числовая апертура по апертурному углу и глубина резкости.
Формулы разрешения и когда какая применяется
| Предел | Формула | Применение |
|---|---|---|
| Аббе | d = длина волны ÷ (2 × NA) | Самая мелкая периодическая деталь, которую пропускает объектив |
| Рэлей | r = 0,61 × длина волны ÷ NA | Два точечных источника, объектив и конденсор согласованы (или флуоресценция) |
| Светлое поле с конденсором | r = 1,22 × длина волны ÷ (NAobj + NAcond) | Проходящий свет, когда NA конденсора меньше, чем у объектива |
| Аксиальное, широкопольная | z ≈ 2 × длина волны × n ÷ NA² | Насколько тонкий слой отделяет широкопольное изображение |
| Конфокальная, малый пинхол | 0,37 × длина волны ÷ NA латерально; 0,64 × длина волны ÷ (n − √(n² − NA²)) аксиально | FWHM при пинхоле меньше 0,25 единицы Эйри (Zeiss) |
Под длиной волны понимается длина волны эмиссии для широкопольной флуоресценции и среднее значение длин волн возбуждения и эмиссии для конфокальной микроскопии; NA — числовая апертура объектива, n — показатель преломления иммерсионной среды. Увеличение нигде не фигурирует: оно определяет, насколько крупной выглядит деталь, а не то, разрешается ли она. Это теоретически наилучшие значения; разъюстированный конденсор, низкий контраст, толстые образцы и несоответствие показателей преломления ухудшают реальное разрешение.
Пример расчёта: эмиссия 520 нм и масляный объектив с NA 1,4: Рэлей 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 нм; Аббе 520 ÷ 2,8 = 186 нм; аксиальное — около 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 нм.
Дискретизация по Найквисту: насколько малыми должны быть пиксели
Чтобы зарегистрировать детали, разрешаемые оптикой, размер пикселя в плоскости образца должен быть не больше половины наименьшего разрешаемого периода. Справочник SVI по критерию Найквиста приводит критический шаг дискретизации как длина волны эмиссии ÷ (4 × NA) для широкопольной и длина волны возбуждения ÷ (8 × NA) для конфокальной микроскопии; многие центры коллективного пользования для запаса просто делят разрешение на 2,3. Более крупные пиксели безвозвратно теряют детали (недостаточная дискретизация); намного более мелкие лишь отнимают свет, время и место на диске, если только вы не планируете деконволюцию.
Проверьте фактический размер пикселя с помощью калькулятора размера пикселя: пиксель камеры 6,5 µm за объективом 60× даёт 108 нм в плоскости образца, что немного грубее, чем нужно для света 520 нм при NA 1,4 (по Найквисту 93 нм).
Числовая апертура
NA = n × sin(половинный угол)
Половинный угол — это половина угла раскрытия светового конуса, который принимает объектив, а n — показатель преломления между покровным стеклом и фронтальной линзой. В воздухе NA не может достичь 1; реальные сухие объективы ограничены примерно 0,95. Водная иммерсия достигает около 1,27, силиконовое масло — около 1,35, масляная иммерсия — от 1,4 до 1,49. NA объектива гравируется после увеличения, например «60×/1.40 Oil».
Глубина резкости (MicroscopyU): d = длина волны × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), где e — наименьшее расстояние, которое разрешает детектор (примерно пиксель камеры), а M — увеличение объектива. У объективов с высокой NA очень малая глубина резкости, поэтому для толстого среза нужен Z-стек.
Вопросы
Каково разрешение светового микроскопа?
Около 200–250 нм в латеральном направлении с масляным объективом с высокой NA в видимом свете (0,61 × 520 нм ÷ 1,4 ≈ 227 нм по критерию Рэлея) и примерно 500–800 нм вдоль оптической оси.
Чем отличаются пределы Аббе и Рэлея?
Предел Аббе (длина волны ÷ 2NA) — самая мелкая периодическая структура, которую пропускает объектив; критерий Рэлея (0,61 × длина волны ÷ NA) — расстояние, на котором два точечных источника ещё можно различить. Оба пропорциональны длине волны ÷ NA; значение по Рэлею более консервативное.
Как рассчитать числовую апертуру?
NA = n × sin(половинный угол), где n — показатель преломления иммерсионной среды, а половинный угол — половина угла раскрытия светового конуса. У сухого объектива с половинным углом 64° NA = sin 64° ≈ 0,90.
Какой размер пикселя нужен для дискретизации по Найквисту?
Не больше длины волны ÷ (4 × NA) в плоскости препарата для широкопольной микроскопии (длина волны эмиссии) и длины волны ÷ (8 × NA) для конфокальной (длина волны возбуждения). Для 520 нм и NA 1,4 это около 93 нм (широкопольная) или 46 нм (конфокальная).
Даёт ли большее увеличение лучшее разрешение?
Нет. Разрешение определяется NA и длиной волны. Большее увеличение без большей NA лишь увеличивает то же размытие («пустое увеличение»).
Этот калькулятор бесплатный?
Да. Он работает в вашем браузере и никуда ничего не отправляет. SlideScope — настольное приложение для микроскопии от той же команды — платное, с бесплатной библиотекой образцов (все инструменты) и подпиской для ваших собственных изображений.
Источники
- Nikon MicroscopyU — Resolution
- Nikon MicroscopyU — Depth of field and depth of focus
- ZEISS — Basics of confocal laser scanning microscopy (Wilhelm)
- SVI Huygens — The Nyquist rate
Результаты носят теоретический или арифметический характер; прежде чем полагаться на них в клинической или регулируемой работе, сверьте их с документацией вашего прибора.
Измеряйте на своих реальных изображениях
SlideScope открывает 34 формата микроскопов и сканеров слайдов, в том числе CZI, ND2, SVS и LIF, с их собственной калибровкой, поэтому длины, площади, подсчёт клеток и масштабные линейки получаются в µm без какой-либо настройки. Попробуйте все инструменты бесплатно на встроенных образцах; чтобы открывать собственные изображения, нужна подписка. Уже решили? Оформите подписку.