Optika
Kalkulačka rozlišení mikroskopu a numerické apertury
Zadejte vlnovou délku a numerickou aperturu objektivu a uvidíte, jak jemný detail dokáže rozlišit laterálně i podél optické osy při širokopolém i konfokálním zobrazování a jak malé musí být vaše pixely, aby ho zachytily (Nyquist). Níže: numerická apertura z akceptančního úhlu a hloubka ostrosti.
Vzorce pro rozlišení a kdy který platí
| Mez | Vzorec | Použití |
|---|---|---|
| Abbe | d = vlnová délka ÷ (2 × NA) | Nejjemnější periodický detail, který objektiv přenese |
| Rayleigh | r = 0.61 × vlnová délka ÷ NA | Dva bodové zdroje, objektiv a kondenzor se stejnou NA (nebo fluorescence) |
| Světlé pole s kondenzorem | r = 1.22 × vlnová délka ÷ (NAobj + NAcond) | Procházející světlo, když je NA kondenzoru nižší než NA objektivu |
| Axiální, širokopolé | z ≈ 2 × vlnová délka × n ÷ NA² | Jak tenkou vrstvu širokopolý snímek oddělí |
| Konfokální, malý pinhole | 0.37 × vlnová délka ÷ NA laterálně; 0.64 × vlnová délka ÷ (n − √(n² − NA²)) axiálně | FWHM s pinholem pod 0.25 Airyho jednotky (Zeiss) |
Vlnovou délkou se u širokopolé fluorescence rozumí emisní vlnová délka a u konfokální mikroskopie průměr excitační a emisní; NA je numerická apertura objektivu a n index lomu imerzního média. Zvětšení se nikde neobjevuje: rozhoduje o tom, jak velký detail vypadá, ne o tom, zda je rozlišen. Jde o teoretické nejlepší případy; špatně seřízený kondenzor, nízký kontrast, tlusté vzorky i nesoulad indexů lomu skutečné rozlišení zhoršují.
Řešený příklad: emise 520 nm a olejový objektiv s NA 1.4: Rayleigh 0.61 × 520 ÷ 1.4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2.8 = 186 nm; axiálně přibližně 2 × 520 × 1.518 ÷ 1.96 = 805 nm.
Vzorkování podle Nyquista: jak malé musí být vaše pixely
Aby se zaznamenal detail, který optika rozliší, musí být velikost pixelu ve vzorku nejvýše polovinou nejmenší rozlišené periody. Referenční text SVI o Nyquistově frekvenci uvádí kritickou vzorkovací vzdálenost jako emisní vlnová délka ÷ (4 × NA) pro širokopolé zobrazení a excitační vlnová délka ÷ (8 × NA) pro konfokální; mnoho pracovišť pro bezpečnou rezervu jednoduše dělí rozlišení číslem 2.3. Větší pixely detail nenávratně ztrácejí (podvzorkování); mnohem menší stojí jen světlo, čas a místo na disku, pokud neplánujete dekonvoluci.
Svou skutečnou velikost pixelu ověřte pomocí kalkulačky velikosti pixelu: pixel kamery 6.5 µm za objektivem 60× odpovídá ve vzorku 108 nm, což světlo 520 nm při NA 1.4 (Nyquist 93 nm) vzorkuje mírně hrubě.
Numerická apertura
NA = n × sin(poloviční úhel)
Poloviční úhel je polovina vrcholového úhlu světelného kužele, který objektiv přijímá, a n je index lomu mezi krycím sklíčkem a čelní čočkou. Na vzduchu NA nemůže dosáhnout 1; skutečné suché objektivy končí přibližně na 0.95. Vodní imerze dosahuje asi 1.27, silikonový olej asi 1.35 a olejová imerze asi 1.4 až 1.49. NA objektivu je vyryta za jeho zvětšením, například „60×/1.40 Oil“.
Hloubka ostrosti (MicroscopyU): d = vlnová délka × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), kde e je nejmenší vzdálenost, kterou detektor rozliší (přibližně pixel kamery), a M zvětšení objektivu. Objektivy s vysokou NA mají velmi malou hloubku ostrosti, a proto tlustý řez potřebuje Z-stack.
Otázky
Jaké je rozlišení světelného mikroskopu?
Přibližně 200–250 nm laterálně s olejovým objektivem s vysokou NA ve viditelném světle (0.61 × 520 nm ÷ 1.4 ≈ 227 nm podle Rayleighova kritéria) a zhruba 500–800 nm podél optické osy.
Jaký je rozdíl mezi Abbeho a Rayleighovou mezí?
Abbeho mez (vlnová délka ÷ 2NA) je nejjemnější periodická struktura, kterou objektiv přenese; Rayleighova (0.61 × vlnová délka ÷ NA) je vzdálenost, při níž lze dva bodové zdroje právě ještě rozlišit. Obě se škálují s poměrem vlnová délka ÷ NA; Rayleighova je konzervativnější číslo.
Jak vypočítat numerickou aperturu?
NA = n × sin(poloviční úhel), kde n je index lomu imerzního média a poloviční úhel je polovina vrcholového úhlu světelného kužele. Suchý objektiv s polovičním úhlem 64° má NA = sin 64° ≈ 0.90.
Jakou velikost pixelu potřebuji pro vzorkování podle Nyquista?
Ve vzorku nejvýše vlnová délka ÷ (4 × NA) pro širokopolé zobrazení (emisní vlnová délka), vlnová délka ÷ (8 × NA) pro konfokální (excitační vlnová délka). Pro 520 nm a NA 1.4 je to přibližně 93 nm (širokopolé) nebo 46 nm (konfokální).
Dává vyšší zvětšení lepší rozlišení?
Ne. Rozlišení určuje NA a vlnová délka. Vyšší zvětšení bez vyšší NA jen zvětší stejnou neostrost ("prázdné zvětšení").
Je tato kalkulačka zdarma?
Ano. Běží ve vašem prohlížeči a nikam nic neposílá. SlideScope, desktopová aplikace pro mikroskopii od stejného týmu, je placená aplikace s bezplatnou knihovnou ukázek (všechny nástroje) a předplatným pro vlastní snímky.
Zdroje
- Nikon MicroscopyU — Resolution
- Nikon MicroscopyU — Depth of field and depth of focus
- ZEISS — Basics of confocal laser scanning microscopy (Wilhelm)
- SVI Huygens — The Nyquist rate
Výsledky jsou teoretické nebo aritmetické; než se na ně budete spoléhat při klinické nebo regulované práci, ověřte je podle dokumentace svého přístroje.
Měřte na svých skutečných snímcích
SlideScope otevře 34 formátů mikroskopů a skenerů preparátů, mimo jiné CZI, ND2, SVS a LIF, s jejich vlastní kalibrací, takže délky, plochy, počty buněk i měřítka vycházejí v µm bez jakéhokoli nastavování. Vyzkoušejte všechny nástroje zdarma na vestavěných ukázkách; pro otevírání vlastních snímků potřebujete předplatné. Už máte jasno? Předplaťte si ho.