Optiek
Calculator voor microscoopresolutie en numerieke apertuur
Vul de golflengte en de numerieke apertuur van het objectief in en zie hoe fijn een detail het kan scheiden, lateraal en langs de optische as, voor widefield- en confocale beeldvorming, en hoe klein je pixels moeten zijn om het vast te leggen (Nyquist). Daaronder: de numerieke apertuur uit de acceptatiehoek, en de scherptediepte.
Resolutieformules, en wanneer elk van toepassing is
| Grens | Formule | Gebruik voor |
|---|---|---|
| Abbe | d = golflengte ÷ (2 × NA) | Het fijnste periodieke detail dat het objectief doorlaat |
| Rayleigh | r = 0,61 × golflengte ÷ NA | Twee puntbronnen, objectief en condensor gelijk (of fluorescentie) |
| Helderveld met condensor | r = 1,22 × golflengte ÷ (NAobj + NAcond) | Doorvallend licht als de NA van de condensor lager is dan die van het objectief |
| Axiaal, widefield | z ≈ 2 × golflengte × n ÷ NA² | Hoe dun een plak is die een widefield-beeld scheidt |
| Confocaal, kleine pinhole | 0,37 × golflengte ÷ NA lateraal; 0,64 × golflengte ÷ (n − √(n² − NA²)) axiaal | FWHM met de pinhole onder 0,25 Airy-eenheden (Zeiss) |
Golflengte betekent de emissiegolflengte bij widefield-fluorescentie en een gemiddelde van excitatie en emissie bij confocaal; NA is de numerieke apertuur van het objectief en n de brekingsindex van het immersiemedium. Vergroting komt nergens voor: die bepaalt hoe groot het detail eruitziet, niet of het wordt opgelost. Dit zijn theoretische beste gevallen; een slecht uitgelijnde condensor, laag contrast, dikke preparaten en een verschil in brekingsindex maken de werkelijke resolutie allemaal slechter.
Rekenvoorbeeld: emissie van 520 nm en een olieobjectief met NA 1,4: Rayleigh 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2,8 = 186 nm; axiaal ongeveer 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 nm.
Nyquist-bemonstering: hoe klein je pixels moeten zijn
Om detail vast te leggen dat de optiek oplost, mag de pixelgrootte op het preparaat hoogstens de helft zijn van de kleinste opgeloste periode. De Nyquist-referentie van SVI geeft de kritische bemonsteringsafstand als emissiegolflengte ÷ (4 × NA) voor widefield en excitatiegolflengte ÷ (8 × NA) voor confocaal; veel faciliteiten delen de resolutie gewoon door 2,3 als veiligheidsmarge. Grotere pixels verliezen detail voorgoed (onderbemonstering); veel kleinere kosten alleen licht, tijd en schijfruimte, tenzij je wilt deconvolueren.
Controleer je werkelijke pixelgrootte met de pixelgroottecalculator: een camerapixel van 6,5 µm achter een 60×-objectief is 108 nm op het preparaat, wat licht van 520 nm bij NA 1,4 (Nyquist 93 nm) iets te grof bemonstert.
Numerieke apertuur
NA = n × sin(halve openingshoek)
De halve openingshoek is de helft van de openingshoek van de lichtkegel die het objectief opvangt, en n is de brekingsindex tussen het dekglaasje en de frontlens. In lucht kan de NA niet tot 1 komen; echte droge objectieven houden op bij ongeveer 0,95. Waterimmersie haalt ongeveer 1,27, siliconenolie ongeveer 1,35 en olie-immersie ongeveer 1,4 tot 1,49. De NA van een objectief staat erop gegraveerd na de vergroting, bijvoorbeeld "60×/1.40 Oil".
Scherptediepte (MicroscopyU): d = golflengte × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), waarbij e de kleinste afstand is die de detector oplost (ongeveer een camerapixel) en M de vergroting van het objectief. Objectieven met een hoge NA hebben een zeer geringe scherptediepte, en daarom heeft een dikke coupe een Z-stack nodig.
Vragen
Wat is de resolutie van een lichtmicroscoop?
Ongeveer 200–250 nm lateraal met een olieobjectief met hoge NA in zichtbaar licht (0,61 × 520 nm ÷ 1,4 ≈ 227 nm volgens het Rayleigh-criterium), en ruwweg 500–800 nm langs de optische as.
Wat is het verschil tussen de grens van Abbe en die van Rayleigh?
Abbe (golflengte ÷ 2NA) is de fijnste periodieke structuur die een objectief doorlaat; Rayleigh (0,61 × golflengte ÷ NA) is de afstand waarop twee puntbronnen net van elkaar te onderscheiden zijn. Beide schalen met golflengte ÷ NA; Rayleigh is het voorzichtigere getal.
Hoe bereken je de numerieke apertuur?
NA = n × sin(halve openingshoek), waarbij n de brekingsindex van het immersiemedium is en de halve openingshoek de helft van de openingshoek van de lichtkegel. Een droog objectief met een halve openingshoek van 64° heeft NA = sin 64° ≈ 0,90.
Welke pixelgrootte heb ik nodig voor Nyquist-bemonstering?
Hoogstens golflengte ÷ (4 × NA) op het preparaat voor widefield (emissiegolflengte), golflengte ÷ (8 × NA) voor confocaal (excitatiegolflengte). Voor 520 nm en NA 1,4 is dat ongeveer 93 nm (widefield) of 46 nm (confocaal).
Geeft een hogere vergroting een betere resolutie?
Nee. De resolutie wordt bepaald door NA en golflengte. Een hogere vergroting zonder hogere NA vergroot dezelfde onscherpte ("lege vergroting").
Is deze calculator gratis?
Ja. Hij draait in je browser en stuurt nergens iets naartoe. SlideScope, de desktopapp voor microscopie van hetzelfde team, is een betaalde app met een gratis voorbeeldbibliotheek (elke tool) en een abonnement voor je eigen beelden.
Bronnen
- Nikon MicroscopyU — Resolution
- Nikon MicroscopyU — Depth of field and depth of focus
- ZEISS — Basics of confocal laser scanning microscopy (Wilhelm)
- SVI Huygens — The Nyquist rate
De resultaten zijn theoretisch of rekenkundig; controleer ze aan de hand van de documentatie van je instrument voordat je erop vertrouwt voor klinisch of gereguleerd werk.
Meet op je echte beelden
SlideScope opent 34 formaten van microscopen en slidescanners, waaronder CZI, ND2, SVS en LIF, met hun eigen kalibratie, zodat lengtes, oppervlakken, celtellingen en schaalbalken in µm uitkomen zonder dat je iets hoeft in te stellen. Probeer elke tool gratis op de ingebouwde voorbeelden; voor het openen van je eigen beelden heb je een abonnement nodig. Al besloten? Nu abonneren.