Optique
Calculateur de résolution et d’ouverture numérique au microscope
Saisissez la longueur d’onde et l’ouverture numérique (ON) de l’objectif pour voir quel niveau de détail il peut séparer, latéralement et le long de l’axe optique, en imagerie plein champ et confocale, et quelle taille vos pixels doivent avoir au maximum pour le capturer (Nyquist). Plus bas : l’ouverture numérique à partir de l’angle d’acceptance, et la profondeur de champ.
Les formules de résolution, et quand chacune s’applique
| Limite | Formule | À utiliser pour |
|---|---|---|
| Abbe | d = longueur d’onde ÷ (2 × ON) | Le détail périodique le plus fin que l’objectif transmet |
| Rayleigh | r = 0,61 × longueur d’onde ÷ ON | Deux sources ponctuelles, objectif et condenseur de même ON (ou fluorescence) |
| Fond clair avec condenseur | r = 1,22 × longueur d’onde ÷ (ONobj + ONcond) | Lumière transmise lorsque l’ON du condenseur est inférieure à celle de l’objectif |
| Axiale, plein champ | z ≈ 2 × longueur d’onde × n ÷ ON² | L’épaisseur de la tranche qu’une image en plein champ parvient à isoler |
| Confocal, petit pinhole | 0,37 × longueur d’onde ÷ ON en latéral ; 0,64 × longueur d’onde ÷ (n − √(n² − ON²)) en axial | LMH avec un pinhole inférieur à 0,25 unité d’Airy (Zeiss) |
La longueur d’onde désigne la longueur d’onde d’émission en fluorescence plein champ, et une moyenne des longueurs d’onde d’excitation et d’émission en confocal ; ON est l’ouverture numérique de l’objectif et n l’indice de réfraction du milieu d’immersion. Le grossissement n’apparaît nulle part : il détermine la taille apparente du détail, pas le fait qu’il soit résolu. Il s’agit de cas idéaux théoriques ; un condenseur mal aligné, un faible contraste, des échantillons épais et une différence d’indice de réfraction dégradent tous la résolution réelle.
Exemple détaillé : émission à 520 nm et objectif à immersion dans l’huile d’ON 1,4 : Rayleigh 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 nm ; Abbe 520 ÷ 2,8 = 186 nm ; axiale environ 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 nm.
Échantillonnage de Nyquist : quelle taille de pixel ne pas dépasser
Pour enregistrer les détails que l’optique résout, la taille de pixel dans l’échantillon doit valoir au plus la moitié de la plus petite période résolue. La référence Nyquist de SVI donne comme distance d’échantillonnage critique longueur d’onde d’émission ÷ (4 × ON) en plein champ et longueur d’onde d’excitation ÷ (8 × ON) en confocal ; de nombreuses plateformes divisent simplement la résolution par 2,3 pour garder une marge de sécurité. Des pixels plus grands perdent définitivement des détails (sous-échantillonnage) ; des pixels beaucoup plus petits ne coûtent que de la lumière, du temps et de l’espace disque, sauf si vous prévoyez une déconvolution.
Vérifiez votre taille de pixel réelle avec le calculateur de taille de pixel : un pixel de caméra de 6,5 µm derrière un objectif 60× correspond à 108 nm dans l’échantillon, ce qui échantillonne un peu trop grossièrement une lumière de 520 nm à ON 1,4 (Nyquist : 93 nm).
Ouverture numérique
ON = n × sin(demi-angle)
Le demi-angle est la moitié de l’angle d’ouverture du cône de lumière accepté par l’objectif, et n l’indice de réfraction entre la lamelle et la lentille frontale. Dans l’air, l’ON ne peut pas atteindre 1 ; les objectifs à sec réels plafonnent vers 0,95. L’immersion dans l’eau atteint environ 1,27, l’huile de silicone environ 1,35, et l’immersion dans l’huile environ 1,4 à 1,49. L’ON d’un objectif est gravée après son grossissement, par exemple « 60×/1.40 Oil ».
Profondeur de champ (MicroscopyU) : d = longueur d’onde × n ÷ ON² + n × e ÷ (M × ON), où e est la plus petite distance que le détecteur résout (environ un pixel de caméra) et M le grossissement de l’objectif. Les objectifs à forte ON ont une profondeur de champ très faible : c’est pourquoi une coupe épaisse nécessite une pile Z.
Questions
Quelle est la résolution d’un microscope optique ?
Environ 200–250 nm latéralement avec un objectif à immersion dans l’huile de forte ON en lumière visible (0,61 × 520 nm ÷ 1,4 ≈ 227 nm selon le critère de Rayleigh), et environ 500–800 nm le long de l’axe optique.
Quelle est la différence entre les limites d’Abbe et de Rayleigh ?
Abbe (longueur d’onde ÷ 2ON) correspond à la structure périodique la plus fine qu’un objectif transmet ; Rayleigh (0,61 × longueur d’onde ÷ ON) est la distance à laquelle deux sources ponctuelles peuvent tout juste être distinguées. Les deux sont proportionnelles à longueur d’onde ÷ ON ; Rayleigh est la valeur la plus prudente.
Comment calcule-t-on l’ouverture numérique ?
ON = n × sin(demi-angle), où n est l’indice de réfraction du milieu d’immersion et le demi-angle la moitié de l’angle d’ouverture du cône de lumière. Un objectif à sec qui accepte un demi-angle de 64° a une ON = sin 64° ≈ 0,90.
Quelle taille de pixel faut-il pour un échantillonnage de Nyquist ?
Au plus longueur d’onde ÷ (4 × ON) dans l’échantillon en plein champ (longueur d’onde d’émission), et longueur d’onde ÷ (8 × ON) en confocal (longueur d’onde d’excitation). Pour 520 nm et une ON de 1,4, cela donne environ 93 nm (plein champ) ou 46 nm (confocal).
Un grossissement plus fort donne-t-il une meilleure résolution ?
Non. La résolution est fixée par l’ON et la longueur d’onde. Un grossissement plus fort sans ON plus élevée agrandit simplement le même flou ("grossissement vide").
Ce calculateur est-il gratuit ?
Oui. Il s’exécute dans votre navigateur et n’envoie rien nulle part. SlideScope, l’application de microscopie de bureau conçue par la même équipe, est une application payante avec une bibliothèque d’échantillons gratuite (tous les outils) et un abonnement pour vos propres images.
Sources
- Nikon MicroscopyU — Resolution
- Nikon MicroscopyU — Profondeur de champ et profondeur de foyer
- ZEISS — Principes de la microscopie confocale à balayage laser (Wilhelm)
- SVI Huygens — La fréquence de Nyquist
Les résultats sont théoriques ou arithmétiques ; vérifiez-les par rapport à la documentation de votre instrument avant de vous y fier pour un travail clinique ou réglementé.
Mesurez sur vos vraies images
SlideScope ouvre 34 formats de microscopes et de scanners de lames, dont CZI, ND2, SVS et LIF, avec leur propre étalonnage : longueurs, surfaces, comptages de cellules et barres d’échelle sont donnés en µm sans aucun réglage. Essayez gratuitement tous les outils sur les échantillons intégrés ; pour ouvrir vos propres images, il faut un abonnement. Déjà décidé ? Abonnez-vous maintenant.