Optyka
Kalkulator rozdzielczości mikroskopu i apertury numerycznej
Podaj długość fali i aperturę numeryczną obiektywu, aby zobaczyć, jak drobne szczegóły obiektyw potrafi rozdzielić w płaszczyźnie i wzdłuż osi optycznej, w mikroskopii szerokiego pola i konfokalnej, oraz jak małe muszą być piksele, aby je zarejestrować (Nyquist). Niżej: apertura numeryczna z kąta akceptacji oraz głębia ostrości.
Wzory na rozdzielczość i kiedy który stosować
| Granica | Wzór | Zastosowanie |
|---|---|---|
| Abbe | d = długość fali ÷ (2 × NA) | Najdrobniejszy szczegół okresowy przenoszony przez obiektyw |
| Rayleigh | r = 0,61 × długość fali ÷ NA | Dwa źródła punktowe, obiektyw i kondensor dopasowane (lub fluorescencja) |
| Jasne pole z kondensorem | r = 1,22 × długość fali ÷ (NAobj + NAcond) | Światło przechodzące, gdy NA kondensora jest mniejsza niż NA obiektywu |
| Osiowa, szerokie pole | z ≈ 2 × długość fali × n ÷ NA² | Jak cienką warstwę wyodrębnia obraz w mikroskopii szerokiego pola |
| Konfokalna, mały pinhole | 0,37 × długość fali ÷ NA w płaszczyźnie; 0,64 × długość fali ÷ (n − √(n² − NA²)) osiowo | FWHM przy pinhole poniżej 0,25 jednostki Airy’ego (Zeiss) |
Długość fali oznacza długość fali emisji w fluorescencyjnej mikroskopii szerokiego pola oraz średnią z długości fali wzbudzenia i emisji w mikroskopii konfokalnej; NA to apertura numeryczna obiektywu, a n to współczynnik załamania ośrodka immersyjnego. Powiększenie nie występuje nigdzie: decyduje o tym, jak duży wydaje się szczegół, a nie o tym, czy zostanie rozdzielony. To teoretyczne najlepsze przypadki; źle ustawiony kondensor, niski kontrast, grube próbki i niedopasowanie współczynników załamania pogarszają rzeczywistą rozdzielczość.
Przykład: emisja 520 nm i obiektyw olejowy o NA 1,4: Rayleigh 0,61 × 520 ÷ 1,4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2,8 = 186 nm; osiowo około 2 × 520 × 1,518 ÷ 1,96 = 805 nm.
Próbkowanie Nyquista: jak małe muszą być piksele
Aby zarejestrować szczegóły rozdzielane przez układ optyczny, rozmiar piksela w preparacie musi wynosić najwyżej połowę najmniejszego rozdzielanego okresu. Materiały referencyjne SVI dotyczące Nyquista podają krytyczny odstęp próbkowania jako długość fali emisji ÷ (4 × NA) dla mikroskopii szerokiego pola i długość fali wzbudzenia ÷ (8 × NA) dla mikroskopii konfokalnej; wiele pracowni po prostu dzieli rozdzielczość przez 2,3, aby mieć margines bezpieczeństwa. Większe piksele bezpowrotnie tracą szczegóły (podpróbkowanie); znacznie mniejsze kosztują jedynie światło, czas i miejsce na dysku, chyba że planujesz dekonwolucję.
Sprawdź swój rzeczywisty rozmiar piksela za pomocą kalkulatora rozmiaru piksela: piksel kamery 6,5 µm za obiektywem 60× to 108 nm w preparacie, co dla światła 520 nm przy NA 1,4 (Nyquist 93 nm) oznacza nieco zbyt rzadkie próbkowanie.
Apertura numeryczna
NA = n × sin(półkąt)
Półkąt to połowa kąta rozwarcia stożka światła przyjmowanego przez obiektyw, a n to współczynnik załamania między szkiełkiem nakrywkowym a soczewką czołową. W powietrzu NA nie może osiągnąć 1; rzeczywiste obiektywy suche kończą się na około 0,95. Immersja wodna osiąga około 1,27, olej silikonowy około 1,35, a immersja olejowa około 1,4–1,49. NA obiektywu jest wygrawerowana po jego powiększeniu, na przykład „60×/1.40 Oil”.
Głębia ostrości (MicroscopyU): d = długość fali × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), gdzie e to najmniejsza odległość rozróżniana przez detektor (mniej więcej piksel kamery), a M to powiększenie obiektywu. Obiektywy o dużej NA mają bardzo płytką głębię ostrości, dlatego gruby skrawek wymaga stosu Z.
Pytania
Jaka jest rozdzielczość mikroskopu świetlnego?
Około 200–250 nm w płaszczyźnie z obiektywem olejowym o dużej NA w świetle widzialnym (0,61 × 520 nm ÷ 1,4 ≈ 227 nm według kryterium Rayleigha) i mniej więcej 500–800 nm wzdłuż osi optycznej.
Czym różni się granica Abbego od granicy Rayleigha?
Granica Abbego (długość fali ÷ 2NA) to najdrobniejsza struktura okresowa przenoszona przez obiektyw; granica Rayleigha (0,61 × długość fali ÷ NA) to odległość, przy której dwa źródła punktowe dają się jeszcze odróżnić. Obie skalują się z ilorazem długość fali ÷ NA; kryterium Rayleigha daje wartość bardziej zachowawczą.
Jak obliczyć aperturę numeryczną?
NA = n × sin(półkąt), gdzie n to współczynnik załamania ośrodka immersyjnego, a półkąt to połowa kąta rozwarcia stożka światła. Obiektyw suchy o półkącie akceptacji 64° ma NA = sin 64° ≈ 0,90.
Jaki rozmiar piksela jest potrzebny do próbkowania Nyquista?
Najwyżej długość fali ÷ (4 × NA) w preparacie dla mikroskopii szerokiego pola (długość fali emisji) i długość fali ÷ (8 × NA) dla mikroskopii konfokalnej (długość fali wzbudzenia). Dla 520 nm i NA 1,4 to około 93 nm (szerokie pole) lub 46 nm (konfokalna).
Czy większe powiększenie daje lepszą rozdzielczość?
Nie. Rozdzielczość wyznaczają NA i długość fali. Większe powiększenie bez większej NA powiększa tylko to samo rozmycie ("puste powiększenie").
Czy ten kalkulator jest bezpłatny?
Tak. Działa w Twojej przeglądarce internetowej i nigdzie niczego nie wysyła. SlideScope, desktopowa aplikacja mikroskopowa tego samego zespołu, to płatna aplikacja z bezpłatną biblioteką przykładów (wszystkie narzędzia) i subskrypcją na własne obrazy.
Źródła
- Nikon MicroscopyU — Resolution
- Nikon MicroscopyU — Depth of field and depth of focus
- ZEISS — Basics of confocal laser scanning microscopy (Wilhelm)
- SVI Huygens — The Nyquist rate
Wyniki są teoretyczne lub arytmetyczne; zanim oprzesz się na nich w pracy klinicznej lub regulowanej, sprawdź je w dokumentacji swojego przyrządu.
Mierz na swoich prawdziwych obrazach
SlideScope otwiera 34 formaty mikroskopów i skanerów preparatów, w tym CZI, ND2, SVS i LIF, z ich własną kalibracją, więc długości, pola powierzchni, liczby komórek i paski skali wychodzą w µm bez żadnej konfiguracji. Wypróbuj wszystkie narzędzia bezpłatnie na wbudowanych przykładach; do otwierania własnych obrazów potrzebna jest subskrypcja. Już zdecydowane? Subskrybuj teraz.