ऑप्टिक्स
माइक्रोस्कोप रिज़ॉल्यूशन और न्यूमेरिकल अपर्चर कैलकुलेटर
वेवलेंथ और ऑब्जेक्टिव का न्यूमेरिकल अपर्चर डालें और देखें कि वाइडफ़ील्ड और कॉन्फ़ोकल इमेजिंग में वह कितनी बारीक डिटेल को अलग कर सकता है, पार्श्व रूप से (लैटरल) भी और ऑप्टिकल अक्ष के साथ भी, और उसे कैप्चर करने के लिए आपके पिक्सेल कितने छोटे होने चाहिए (Nyquist)। नीचे: एक्सेप्टेंस एंगल से न्यूमेरिकल अपर्चर, और डेप्थ ऑफ़ फ़ील्ड।
रिज़ॉल्यूशन के सूत्र, और हर एक कब लागू होता है
| सीमा | फ़ॉर्मूला | किसके लिए उपयोग करें |
|---|---|---|
| Abbe | d = वेवलेंथ ÷ (2 × NA) | ऑब्जेक्टिव से गुज़रने वाली सबसे बारीक आवर्ती (पीरियॉडिक) डिटेल |
| Rayleigh | r = 0.61 × वेवलेंथ ÷ NA | दो पॉइंट स्रोत, ऑब्जेक्टिव और कंडेंसर मिलान किए हुए (या फ़्लोरेसेंस) |
| कंडेंसर के साथ ब्राइटफ़ील्ड | r = 1.22 × वेवलेंथ ÷ (NAobj + NAcond) | ट्रांसमिटेड लाइट, जब कंडेंसर NA ऑब्जेक्टिव के NA से कम हो |
| एक्सियल, वाइडफ़ील्ड | z ≈ 2 × वेवलेंथ × n ÷ NA² | वाइडफ़ील्ड इमेज कितनी पतली परत अलग कर पाती है |
| कॉन्फ़ोकल, छोटा पिनहोल | लैटरल 0.37 × वेवलेंथ ÷ NA; एक्सियल 0.64 × वेवलेंथ ÷ (n − √(n² − NA²)) | पिनहोल 0.25 Airy यूनिट से कम होने पर FWHM (Zeiss) |
वेवलेंथ का मतलब वाइडफ़ील्ड फ़्लोरेसेंस में एमिशन वेवलेंथ और कॉन्फ़ोकल में एक्साइटेशन और एमिशन का औसत है; NA ऑब्जेक्टिव का न्यूमेरिकल अपर्चर है और n इमर्शन माध्यम का अपवर्तनांक (रिफ़्रैक्टिव इंडेक्स)। मैग्निफ़िकेशन कहीं नहीं आता: यह तय करता है कि डिटेल कितनी बड़ी दिखती है, यह नहीं कि वह रिज़ॉल्व होती है या नहीं। ये सैद्धांतिक सर्वोत्तम स्थितियाँ हैं; ठीक से अलाइन न किया गया कंडेंसर, कम कंट्रास्ट, मोटे नमूने और रिफ़्रैक्टिव इंडेक्स का बेमेल, ये सभी असली रिज़ॉल्यूशन को खराब करते हैं।
हल किया गया उदाहरण: 520 nm एमिशन और 1.4 NA ऑयल ऑब्जेक्टिव: Rayleigh 0.61 × 520 ÷ 1.4 = 227 nm; Abbe 520 ÷ 2.8 = 186 nm; एक्सियल लगभग 2 × 520 × 1.518 ÷ 1.96 = 805 nm।
Nyquist सैंपलिंग: आपके पिक्सेल कितने छोटे होने चाहिए
ऑप्टिक्स जो डिटेल रिज़ॉल्व करते हैं उसे रिकॉर्ड करने के लिए, नमूने पर पिक्सेल आकार सबसे छोटे रिज़ॉल्व हुए पीरियड का अधिकतम आधा होना चाहिए। SVI का Nyquist संदर्भ क्रिटिकल सैंपलिंग दूरी वाइडफ़ील्ड के लिए एमिशन वेवलेंथ ÷ (4 × NA) और कॉन्फ़ोकल के लिए एक्साइटेशन वेवलेंथ ÷ (8 × NA) बताता है; कई फ़ैसिलिटी सुरक्षा मार्जिन के लिए बस रिज़ॉल्यूशन को 2.3 से भाग देती हैं। बड़े पिक्सेल से डिटेल हमेशा के लिए खो जाती है (अंडरसैंपलिंग); बहुत छोटे पिक्सेल सिर्फ़ रोशनी, समय और डिस्क स्पेस खर्च करते हैं, जब तक कि आप डीकॉन्वॉल्व करने की योजना न बना रहे हों।
पिक्सेल आकार कैलकुलेटर से अपना असली पिक्सेल आकार जाँचें: 60× ऑब्जेक्टिव के पीछे 6.5 µm कैमरा पिक्सेल नमूने पर 108 nm होता है, जो 1.4 NA पर 520 nm रोशनी को (Nyquist 93 nm) थोड़ा मोटे तौर पर सैंपल करता है।
न्यूमेरिकल अपर्चर
NA = n × sin(हाफ़-एंगल)
हाफ़-एंगल, ऑब्जेक्टिव जिस प्रकाश शंकु को स्वीकार करता है, उसके खुलने के कोण का आधा है, और n कवरस्लिप और फ़्रंट लेंस के बीच का रिफ़्रैक्टिव इंडेक्स। हवा में NA 1 तक नहीं पहुँच सकता; असली ड्राई ऑब्जेक्टिव लगभग 0.95 पर रुक जाते हैं। वॉटर इमर्शन लगभग 1.27, सिलिकॉन ऑयल लगभग 1.35, और ऑयल इमर्शन लगभग 1.4 से 1.49 तक पहुँचता है। ऑब्जेक्टिव का NA उसके मैग्निफ़िकेशन के बाद खुदा होता है, उदाहरण के लिए "60×/1.40 Oil"।
डेप्थ ऑफ़ फ़ील्ड (MicroscopyU): d = वेवलेंथ × n ÷ NA² + n × e ÷ (M × NA), जहाँ e वह सबसे छोटी दूरी है जिसे डिटेक्टर रिज़ॉल्व करता है (लगभग एक कैमरा पिक्सेल) और M ऑब्जेक्टिव मैग्निफ़िकेशन। हाई-NA ऑब्जेक्टिव की डेप्थ ऑफ़ फ़ील्ड बहुत कम होती है, इसीलिए मोटे सेक्शन के लिए Z-स्टैक की ज़रूरत होती है।
प्रश्न
लाइट माइक्रोस्कोप का रिज़ॉल्यूशन कितना होता है?
दृश्य प्रकाश में हाई-NA ऑयल ऑब्जेक्टिव के साथ लैटरल रूप से लगभग 200–250 nm (Rayleigh मानदंड से 0.61 × 520 nm ÷ 1.4 ≈ 227 nm), और ऑप्टिकल अक्ष के साथ मोटे तौर पर 500–800 nm।
Abbe और Rayleigh सीमाओं में क्या अंतर है?
Abbe (वेवलेंथ ÷ 2NA) वह सबसे बारीक आवर्ती संरचना है जिसे ऑब्जेक्टिव पार होने देता है; Rayleigh (0.61 × वेवलेंथ ÷ NA) वह दूरी है जिस पर दो पॉइंट स्रोतों को बस अलग-अलग पहचाना जा सकता है। दोनों वेवलेंथ ÷ NA के अनुपात में बदलते हैं; Rayleigh ज़्यादा सतर्क संख्या है।
न्यूमेरिकल अपर्चर की गणना कैसे करें?
NA = n × sin(हाफ़-एंगल), जहाँ n इमर्शन माध्यम का रिफ़्रैक्टिव इंडेक्स है और हाफ़-एंगल प्रकाश शंकु के खुलने के कोण का आधा है। 64° हाफ़-एंगल स्वीकार करने वाले ड्राई ऑब्जेक्टिव का NA = sin 64° ≈ 0.90 होता है।
Nyquist सैंपलिंग के लिए मुझे कितना पिक्सेल आकार चाहिए?
नमूने पर अधिकतम, वाइडफ़ील्ड के लिए वेवलेंथ ÷ (4 × NA) (एमिशन वेवलेंथ), कॉन्फ़ोकल के लिए वेवलेंथ ÷ (8 × NA) (एक्साइटेशन वेवलेंथ)। 520 nm और NA 1.4 के लिए यह लगभग 93 nm (वाइडफ़ील्ड) या 46 nm (कॉन्फ़ोकल) है।
क्या ज़्यादा मैग्निफ़िकेशन से बेहतर रिज़ॉल्यूशन मिलता है?
नहीं। रिज़ॉल्यूशन NA और वेवलेंथ से तय होता है। ज़्यादा NA के बिना ज़्यादा मैग्निफ़िकेशन उसी धुंधलेपन को बस बड़ा कर देता है ("खाली मैग्निफ़िकेशन")।
क्या यह कैलकुलेटर मुफ़्त है?
हाँ। यह आपके ब्राउज़र में चलता है और कहीं कुछ नहीं भेजता। SlideScope, उसी टीम का बनाया डेस्कटॉप माइक्रोस्कोपी ऐप, एक पेड ऐप है जिसके साथ मुफ़्त सैंपल लाइब्रेरी (हर टूल के साथ) मिलती है और आपकी अपनी इमेज के लिए सदस्यता लेनी होती है।
स्रोत
- Nikon MicroscopyU — रिज़ॉल्यूशन
- Nikon MicroscopyU — डेप्थ ऑफ़ फ़ील्ड और डेप्थ ऑफ़ फ़ोकस
- ZEISS — कॉन्फ़ोकल लेज़र स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी की बुनियादी बातें (Wilhelm)
- SVI Huygens — Nyquist दर
परिणाम सैद्धांतिक या अंकगणितीय हैं; क्लिनिकल या विनियमित काम में इन पर भरोसा करने से पहले इन्हें अपने उपकरण के दस्तावेज़ों से मिलाकर जाँच लें।
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