Підрахунок клітин
Калькулятор гемоцитометра
Введіть те, що ви нарахували в камері, і отримайте концентрацію клітин, життєздатність, загальну кількість клітин і об’єм суспензії, який потрібно взяти. Калькулятор працює для сіток покращеної камери Нойбауера, Бюркера та Фукса-Розенталя, для будь-якого квадрата, який ви рахували, і для будь-якого розведення, зокрема звичайного змішування 1:1 з трипановим синім.
Як працює формула гемоцитометра
Кожен квадрат лічильної сітки містить відомий об’єм: його площу, помножену на глибину камери. У покращеній камері Нойбауера великий квадрат має розмір 1 мм × 1 мм, а глибина камери — 0.1 мм, тож великий квадрат містить 0.1 мм³, тобто 0.1 мкл або 10⁻⁴ мл. Ділення середньої кількості на квадрат на цей об’єм дає клітин на мл; множення на розведення компенсує доданий барвник або буфер.
клітин/мл = (N ÷ квадрати) ÷ (площа мм² × глибина мм) × 1000 × розведення
Розібраний приклад: 200 живих клітин у 4 кутових квадратах, змішано 1:1 з трипановим синім. 200 ÷ 4 = 50 клітин на квадрат; 50 × 10⁴ × 2 = 1.0 × 10⁶ живих клітин/мл. Якщо є ще 10 мертвих клітин, життєздатність становить 200 ÷ 210 = 95.2 %. Щоб посіяти 500,000 клітин, візьміть 500,000 ÷ 1,000,000 = 0.5 мл.
Правила підрахунку, що зберігають точність числа
- Правило меж: рахуйте клітини, що торкаються верхньої та лівої ліній квадрата, і пропускайте ті, що торкаються нижньої та правої, щоб жодну клітину не порахувати двічі.
- Рахуйте достатньо клітин: похибка підрахунку пуассонівська, приблизно 1/√N. 100 клітин дають приблизно ±10 %, 400 клітин — близько ±5 %. Якщо щільність низька, рахуйте більше квадратів або обидві камери.
- Розводьте густі зразки: якщо у великому квадраті більше приблизно 100 клітин, клітини перекриваються, і частину пропускають. Розведіть, перерахуйте й введіть новий коефіцієнт розведення.
- Трипановий синій: змішування 1:1 з 0.4 % трипановим синім — це коефіцієнт розведення 2. Рахуйте протягом кількох хвилин, бо живі клітини починають поглинати барвник, і що довше вони стоять, то нижча життєздатність.
- Перемішайте перед заповненням: клітини осідають у пробірці за лічені секунди; піпетуйте вгору-вниз, а потім заповніть камеру одним плавним рухом, не переповнюючи її.
Який квадрат ви рахували?
| Камера й квадрат | Площа | Глибина | Об’єм на квадрат | Множник (× кількість на квадрат) |
|---|---|---|---|---|
| Покращена камера Нойбауера або Бюркера, великий квадрат | 1 мм² | 0.1 mm | 0.1 мкл | 10⁴ |
| Покращена камера Нойбауера, один із 25 центральних квадратів | 0.04 мм² | 0.1 mm | 4 нл | 2.5 × 10⁵ |
| Покращена камера Нойбауера, найменший квадрат | 0.0025 мм² | 0.1 mm | 0.25 нл | 4 × 10⁶ |
| Фукс-Розенталь, квадрат 1 мм | 1 мм² | 0.2 mm | 0.2 мкл | 5 × 10³ |
Множник застосовується до кількості клітин на квадрат, до врахування розведення. Одноразові лічильні слайди зазвичай повторюють сітку покращеної камери Нойбауера з глибиною 0.1 мм; якщо сумніваєтеся, перевірте вкладиш до слайда.
Підрахунок клітин на зображеннях
Гемоцитометр рахує клітини в суспензії. Щоб порахувати ядра або клітини на мікрофотографії чи повнослайдовому зображенні, скористайтеся аналізом зображень: Analyze Particles у Fiji, QuPath, CellProfiler або SlideScope, який рахує ядра й клітини на вашому власному комп’ютері без коду та повідомляє щільність на мм² за калібруванням зображення. Див. як рахувати клітини на мікроскопічних зображеннях.
Запитання
Як обчислити кількість клітин на мл за гемоцитометром?
Усередніть кількість на квадрат, поділіть на об’єм одного квадрата (площа × глибина; для великого квадрата Нойбауера 1 мм × 1 мм × 0.1 мм = 10⁻⁴ мл) і помножте на коефіцієнт розведення. Для великих квадратів Нойбауера це середнє на квадрат × 10⁴ × розведення.
Який коефіцієнт розведення з трипановим синім?
Змішування рівних об’ємів клітинної суспензії та трипанового синього (наприклад, 10 мкл + 10 мкл) удвічі знижує концентрацію, тому коефіцієнт розведення дорівнює 2. Суміш 1 частини клітин на 4 частини барвника дає коефіцієнт 5.
Як обчислити життєздатність клітин?
Життєздатність (%) = живі клітини ÷ (живі + мертві клітини) × 100. З трипановим синім живі клітини залишаються прозорими, а мертві забарвлюються в синій колір.
Скільки квадратів слід рахувати?
Рахуйте стільки квадратів, щоб набрати щонайменше 100 клітин, а в ідеалі від 200 до 400; похибка становить приблизно 1/√N. Для більшості культур достатньо чотирьох кутових великих квадратів; для розріджених зразків потрібні всі дев’ять або обидві камери.
Чому множити на 10,000?
Один великий квадрат камери Нойбауера містить 0.1 мкл (1 мм × 1 мм × 0.1 мм = 0.1 мм³). В 1 мл вміщується 10,000 таких об’ємів, тому клітин на квадрат × 10,000 = клітин на мл.
Чи цей калькулятор безкоштовний?
Так. Він працює у вашому браузері й нікуди нічого не надсилає. SlideScope, настільна програма для мікроскопії від тієї самої команди, — платна програма з безкоштовною бібліотекою зразків (усі інструменти) і передплатою для ваших власних зображень.
Джерела
Результати теоретичні або арифметичні; звірте їх із документацією вашого приладу, перш ніж покладатися на них у клінічній або регульованій роботі.
Вимірюйте на своїх реальних зображеннях
SlideScope відкриває 34 формати мікроскопів і слайд-сканерів, серед них CZI, ND2, SVS і LIF, з їхнім власним калібруванням, тож довжини, площі, кількість клітин і масштабні лінійки виходять у мкм без жодного налаштування. Спробуйте всі інструменти безкоштовно на вбудованих зразках; щоб відкривати власні зображення, потрібна передплата. Уже вирішили? Оформити передплату зараз.