Đếm tế bào
Máy tính buồng đếm hồng cầu
Nhập số tế bào bạn đã đếm trên buồng đếm để có nồng độ tế bào, tỷ lệ sống, tổng số tế bào và lượng huyền phù cần lấy. Công cụ dùng được cho lưới Neubauer cải tiến, Bürker và Fuchs-Rosenthal, cho bất kỳ ô nào bạn đã đếm, và cho mọi độ pha loãng, kể cả hỗn hợp trypan blue 1:1 thông thường.
Công thức buồng đếm tế bào hoạt động như thế nào
Mỗi ô của lưới đếm chứa một thể tích đã biết: diện tích ô nhân với độ sâu của buồng đếm. Trên buồng đếm Neubauer cải tiến, một ô lớn có kích thước 1 mm × 1 mm và buồng sâu 0,1 mm, nên một ô lớn chứa 0,1 mm³, tức 0,1 µL hay 10⁻⁴ mL. Chia số đếm trung bình mỗi ô cho thể tích đó sẽ ra số tế bào trên mỗi mL; nhân với độ pha loãng để bù lại lượng thuốc nhuộm hoặc dung dịch đệm bạn đã thêm vào.
tế bào/mL = (N ÷ số ô) ÷ (diện tích mm² × độ sâu mm) × 1000 × độ pha loãng
Ví dụ minh họa: 200 tế bào sống trên 4 ô góc, trộn 1:1 với trypan blue. 200 ÷ 4 = 50 tế bào mỗi ô; 50 × 10⁴ × 2 = 1,0 × 10⁶ tế bào sống/mL. Nếu có thêm 10 tế bào chết, tỷ lệ sống là 200 ÷ 210 = 95,2 %. Để cấy 500.000 tế bào, hãy lấy 500.000 ÷ 1.000.000 = 0,5 mL.
Các quy tắc đếm giúp kết quả chính xác
- Quy tắc cạnh: đếm các tế bào chạm vào cạnh trên và cạnh trái của ô, bỏ qua các tế bào chạm vào cạnh dưới và cạnh phải, để không tế bào nào bị đếm hai lần.
- Đếm đủ số tế bào: sai số đếm theo phân phối Poisson, khoảng 1/√N. Đếm 100 tế bào cho sai số khoảng ±10 %, 400 tế bào khoảng ±5 %. Hãy đếm thêm ô, hoặc cả hai buồng, khi mật độ thấp.
- Pha loãng mẫu quá dày: nếu một ô lớn chứa hơn khoảng 100 tế bào, các tế bào sẽ chồng lên nhau và bị đếm sót. Hãy pha loãng, đếm lại và nhập hệ số pha loãng mới.
- Trypan blue: trộn 1:1 với trypan blue 0,4 % tương ứng với hệ số pha loãng là 2. Hãy đếm trong vòng vài phút, vì tế bào sống bắt đầu hấp thu thuốc nhuộm và tỷ lệ sống giảm dần khi để lâu.
- Trộn đều trước khi nạp mẫu: tế bào lắng xuống đáy ống chỉ trong vài giây; hãy hút lên xuống bằng pipet, rồi bơm đầy buồng đếm bằng một lần bơm đều tay mà không để tràn.
Bạn đã đếm loại ô nào?
| Buồng đếm và ô | Diện tích | Độ sâu | Thể tích mỗi ô | Hệ số (× số đếm mỗi ô) |
|---|---|---|---|---|
| Neubauer cải tiến hoặc Bürker, ô lớn | 1 mm² | 0.1 mm | 0,1 µL | 10⁴ |
| Neubauer cải tiến, một trong 25 ô trung tâm | 0,04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Neubauer cải tiến, ô nhỏ nhất | 0,0025 mm² | 0.1 mm | 0,25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal, ô 1 mm | 1 mm² | 0.2 mm | 0,2 µL | 5 × 10³ |
Hệ số tính cho mỗi tế bào đếm được trên mỗi ô, trước khi tính độ pha loãng. Lam đếm dùng một lần thường sao chép lưới Neubauer cải tiến ở độ sâu 0,1 mm; nếu không chắc, hãy xem tờ hướng dẫn đi kèm lam đếm.
Đếm tế bào trên ảnh thay vì trên buồng đếm
Buồng đếm tế bào dùng để đếm tế bào trong huyền phù. Để đếm nhân hoặc tế bào trên ảnh hiển vi hay ảnh toàn tiêu bản, hãy dùng phân tích ảnh: Analyze Particles của Fiji, QuPath, CellProfiler, hoặc SlideScope, ứng dụng đếm nhân và tế bào trên máy tính của chính bạn mà không cần viết mã và báo cáo mật độ trên mỗi mm² dựa trên hiệu chuẩn của ảnh. Xem cách đếm tế bào trong ảnh hiển vi.
Câu hỏi
Làm thế nào để tính số tế bào trên mỗi mL từ buồng đếm tế bào?
Lấy trung bình số đếm mỗi ô, chia cho thể tích của một ô (diện tích × độ sâu; với ô lớn Neubauer là 1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 10⁻⁴ mL) rồi nhân với hệ số pha loãng. Với ô lớn Neubauer, công thức là trung bình mỗi ô × 10⁴ × độ pha loãng.
Hệ số pha loãng khi dùng trypan blue là bao nhiêu?
Trộn huyền phù tế bào và trypan blue với thể tích bằng nhau (ví dụ 10 µL + 10 µL) làm nồng độ giảm một nửa, nên hệ số pha loãng là 2. Hỗn hợp 1 phần tế bào với 4 phần thuốc nhuộm có hệ số là 5.
Làm thế nào để tính tỷ lệ tế bào sống?
Tỷ lệ sống (%) = số tế bào sống ÷ (số tế bào sống + chết) × 100. Với trypan blue, tế bào sống vẫn trong suốt còn tế bào chết bắt màu xanh.
Tôi nên đếm bao nhiêu ô?
Hãy đếm đủ số ô để đạt ít nhất 100 tế bào, lý tưởng là 200 đến 400; sai số khoảng 1/√N. Với phần lớn mẫu nuôi cấy, bốn ô lớn ở góc là đủ; mẫu thưa cần đếm cả chín ô hoặc cả hai buồng.
Vì sao phải nhân với 10.000?
Một ô lớn của buồng đếm Neubauer chứa 0,1 µL (1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 0,1 mm³). Trong 1 mL có 10.000 thể tích như vậy, nên số tế bào mỗi ô × 10.000 = số tế bào trên mỗi mL.
Máy tính này có miễn phí không?
Có. Công cụ chạy trong trình duyệt của bạn và không gửi gì đi đâu cả. SlideScope, ứng dụng hiển vi trên máy tính do cùng đội ngũ phát triển, là ứng dụng trả phí có thư viện mẫu miễn phí (với mọi công cụ) và gói thuê bao cho ảnh của riêng bạn.
Nguồn
Kết quả mang tính lý thuyết hoặc số học; hãy đối chiếu với tài liệu của thiết bị trước khi dựa vào chúng cho công việc lâm sàng hoặc công việc chịu quản lý.
Đo trên ảnh thực của bạn
SlideScope mở 34 định dạng của kính hiển vi và máy quét tiêu bản, trong đó có CZI, ND2, SVS và LIF, với hiệu chuẩn riêng của từng tệp, nên chiều dài, diện tích, số đếm tế bào và thanh tỷ lệ đều ra theo µm mà không cần thiết lập gì. Dùng thử miễn phí mọi công cụ trên các mẫu tích hợp; để mở ảnh của riêng bạn, bạn cần một gói thuê bao. Đã quyết định? Đăng ký ngay.