عدّ الخلايا
حاسبة عدّاد الكريات (الهيموسيتومتر)
أدخل ما عددته على الحجرة واحصل على تركيز الخلايا، ونسبة الحيوية، والعدد الكلي للخلايا، وكمية المعلّق التي يجب أخذها. تعمل الحاسبة مع شبكات Neubauer المحسّنة وBürker وFuchs-Rosenthal، ومع أي مربع عددته، وأي تخفيف، بما في ذلك المزيج المعتاد 1:1 مع أزرق التريبان.
كيف تعمل معادلة الهيموسيتومتر
يحتوي كل مربع في شبكة العدّ على حجم معروف: مساحته مضروبة في عمق الحجرة. في حجرة Neubauer المحسّنة يكون المربع الكبير 1 mm × 1 mm وعمق الحجرة 0.1 mm، لذا يحتوي المربع الكبير على 0.1 mm³، أي 0.1 µL أو 10⁻⁴ mL. قسمة متوسط العدّ لكل مربع على هذا الحجم تعطي الخلايا لكل mL؛ والضرب في التخفيف يُلغي أثر الصبغة أو المحلول المنظّم الذي أضفته.
خلية/mL = (N ÷ المربعات) ÷ (المساحة mm² × العمق mm) × 1000 × التخفيف
مثال محلول: 200 خلية حية في مربعات الزوايا الأربعة، ممزوجة بنسبة 1:1 مع أزرق التريبان. 200 ÷ 4 = 50 خلية لكل مربع؛ 50 × 10⁴ × 2 = 1.0 × 10⁶ خلية حية/mL. ومع وجود 10 خلايا ميتة أيضًا، تكون الحيوية 200 ÷ 210 = 95.2 %. ولزرع 500,000 خلية، خذ 500,000 ÷ 1,000,000 = 0.5 mL.
قواعد عدّ تحافظ على دقة الرقم
- قاعدة الحواف: عُدّ الخلايا التي تلامس الخطين العلوي والأيسر للمربع وتجاهل تلك التي تلامس الخطين السفلي والأيمن، حتى لا تُعدّ أي خلية مرتين.
- عُدّ عددًا كافيًا من الخلايا: يتبع خطأ العدّ توزيع Poisson، أي نحو 1/√N. عدّ 100 خلية يعطي نحو ±10 %، و400 خلية نحو ±5 %. عُدّ مربعات أكثر، أو كلتا الحجرتين، عندما تكون الكثافة منخفضة.
- خفّف العينات المزدحمة: إذا احتوى المربع الكبير على أكثر من 100 خلية تقريبًا، تتداخل الخلايا ويفوتك بعضها. خفّف العينة، وأعد العدّ، وأدخل معامل التخفيف الجديد.
- أزرق التريبان: المزيج 1:1 مع أزرق التريبان بتركيز 0.4 % يعادل معامل تخفيف 2. أجرِ العدّ خلال بضع دقائق، لأن الخلايا الحية تبدأ في امتصاص الصبغة وتنخفض الحيوية كلما طال انتظارها.
- امزج قبل التحميل: تترسب الخلايا في الأنبوب خلال ثوانٍ؛ اسحب المعلّق بالماصة وأفرغه عدة مرات، ثم املأ الحجرة بحركة واحدة سلسة دون ملئها أكثر من اللازم.
أي مربع عددت؟
| الحجرة والمربع | المساحة | العمق | الحجم لكل مربع | المعامل (× العدّ لكل مربع) |
|---|---|---|---|---|
| Neubauer المحسّنة أو Bürker، مربع كبير | 1 mm² | 0.1 mm | 0.1 µL | 10⁴ |
| Neubauer المحسّنة، أحد المربعات المركزية الـ 25 | 0.04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Neubauer المحسّنة، أصغر مربع | 0.0025 mm² | 0.1 mm | 0.25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal، مربع 1 mm | 1 mm² | 0.2 mm | 0.2 µL | 5 × 10³ |
المعامل هو لكل خلية معدودة في كل مربع، قبل التخفيف. شرائح العدّ أحادية الاستخدام تحاكي عادةً شبكة Neubauer المحسّنة بعمق 0.1 mm؛ راجع النشرة المرفقة بالشريحة إن كنت غير متأكد.
عدّ الخلايا في الصور بدلًا من ذلك
يعدّ الهيموسيتومتر الخلايا في المعلّق. أما لعدّ الأنوية أو الخلايا في صورة مجهرية أو في شريحة كاملة، فاستخدم تحليل الصور: Analyze Particles في Fiji، أو QuPath، أو CellProfiler، أو SlideScope الذي يعدّ الأنوية والخلايا على حاسوبك دون كتابة شيفرة، ويحسب الكثافة لكل mm² من معايرة الصورة. اطّلع على كيفية عدّ الخلايا في صور المجهر.
أسئلة
كيف تحسب عدد الخلايا لكل mL من الهيموسيتومتر؟
احسب متوسط العدّ لكل مربع، واقسمه على حجم مربع واحد (المساحة × العمق، وللمربع الكبير في Neubauer: 1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 10⁻⁴ mL)، ثم اضربه في معامل التخفيف. وبالنسبة إلى مربعات Neubauer الكبيرة، يصبح ذلك المتوسط لكل مربع × 10⁴ × التخفيف.
ما معامل التخفيف مع أزرق التريبان؟
مزج حجمين متساويين من معلّق الخلايا وأزرق التريبان (مثلًا 10 µL + 10 µL) يخفض التركيز إلى النصف، لذا يكون معامل التخفيف 2. أما مزيج جزء واحد من الخلايا إلى 4 أجزاء من الصبغة فمعامله 5.
كيف تحسب حيوية الخلايا؟
الحيوية (%) = الخلايا الحية ÷ (الخلايا الحية + الميتة) × 100. مع أزرق التريبان، تبقى الخلايا الحية شفافة وتصطبغ الخلايا الميتة بالأزرق.
كم مربعًا يجب أن أعدّ؟
عُدّ مربعات كافية للوصول إلى 100 خلية على الأقل، ويُفضّل 200 إلى 400؛ فالخطأ نحو 1/√N. في معظم المزارع تكفي المربعات الكبيرة الأربعة في الزوايا؛ أما العينات المتفرقة فتحتاج إلى المربعات التسعة كلها أو إلى كلتا الحجرتين.
لماذا نضرب في 10,000؟
يحتوي مربع كبير واحد في حجرة Neubauer على 0.1 µL (1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 0.1 mm³). ويتسع 1 mL لـ 10,000 من هذه الأحجام، لذا فإن الخلايا لكل مربع × 10,000 = الخلايا لكل mL.
هل هذه الحاسبة مجانية؟
نعم. تعمل في متصفحك ولا ترسل أي شيء إلى أي مكان. أما SlideScope، تطبيق المجهر المكتبي من الفريق نفسه، فهو تطبيق مدفوع مع مكتبة عينات مجانية (بكل الأدوات) واشتراك لصورك الخاصة.
المصادر
النتائج نظرية أو حسابية؛ قارنها بوثائق جهازك قبل الاعتماد عليها في العمل السريري أو الخاضع للتنظيم.
قِس على صورك الحقيقية
يفتح SlideScope 34 صيغة من صيغ المجاهر وماسحات الشرائح، منها CZI وND2 وSVS وLIF، مع المعايرة المسجلة في كل منها، فتظهر الأطوال والمساحات وأعداد الخلايا وأشرطة المقياس بوحدة µm دون أي إعداد. جرّب كل الأدوات مجانًا على العينات المدمجة؛ أما فتح صورك الخاصة فيتطلب اشتراكًا. هل حسمت قرارك؟ اشترك الآن.