Hücre sayma
Hemositometre hesaplayıcısı
Kamarada saydıklarınızı girin; hücre konsantrasyonunu, canlılığı, toplam hücre sayısını ve ne kadar süspansiyon almanız gerektiğini öğrenin. Geliştirilmiş Neubauer, Bürker ve Fuchs-Rosenthal ızgaralarında, saydığınız her kare türünde ve olağan 1:1 tripan mavisi karışımı dahil her seyreltmede çalışır.
Hemositometre formülü nasıl çalışır?
Sayım ızgarasının her karesi bilinen bir hacmi kapsar: alanı çarpı kamaranın derinliği. Geliştirilmiş Neubauer kamarasında büyük bir kare 1 mm × 1 mm’dir ve kamara 0,1 mm derinliğindedir; dolayısıyla büyük bir kare 0,1 mm³, yani 0,1 µL veya 10⁻⁴ mL hacim kapsar. Kare başına ortalama sayımı bu hacme bölmek mL başına hücreyi verir; seyreltmeyle çarpmak ise eklediğiniz boya veya tamponun etkisini geri alır.
hücre/mL = (N ÷ kare) ÷ (alan mm² × derinlik mm) × 1000 × seyreltme
Çözümlü örnek: 4 köşe karede 200 canlı hücre, tripan mavisiyle 1:1 karıştırılmış. 200 ÷ 4 = kare başına 50 hücre; 50 × 10⁴ × 2 = 1,0 × 10⁶ canlı hücre/mL. Ayrıca 10 ölü hücre varsa canlılık 200 ÷ 210 = %95,2 olur. 500.000 hücre ekmek için 500.000 ÷ 1.000.000 = 0,5 mL alın.
Sayımı dürüst tutan sayım kuralları
- Kenar kuralı: bir karenin üst ve sol çizgilerine değen hücreleri sayın, alt ve sağ çizgilere değenleri atlayın; böylece hiçbir hücre iki kez sayılmaz.
- Yeterince hücre sayın: sayım hatası Poisson dağılımına uyar, yaklaşık 1/√N’dir. 100 hücre kabaca ±%10, 400 hücre yaklaşık ±%5 hata verir. Yoğunluk düşük olduğunda daha fazla kare veya her iki kamarayı sayın.
- Kalabalık örnekleri seyreltin: büyük bir karede yaklaşık 100’den fazla hücre varsa hücreler üst üste biner ve gözden kaçar. Seyreltin, yeniden sayın ve yeni seyreltme faktörünü girin.
- Tripan mavisi: %0,4 tripan mavisiyle 1:1 karışım, 2’lik bir seyreltme faktörüdür. Birkaç dakika içinde sayın; çünkü canlı hücreler boyayı almaya başlar ve hücreler bekledikçe canlılık düşer.
- Yüklemeden önce karıştırın: hücreler tüpte saniyeler içinde çöker; pipetle birkaç kez çekip bırakın, ardından kamarayı taşırmadan tek ve düzgün bir hareketle doldurun.
Hangi kareyi saydınız?
| Kamara ve kare | Alan | Derinlik | Kare başına hacim | Faktör (× kare başına sayım) |
|---|---|---|---|---|
| Geliştirilmiş Neubauer veya Bürker, büyük kare | 1 mm² | 0.1 mm | 0,1 µL | 10⁴ |
| Geliştirilmiş Neubauer, 25 merkez kareden biri | 0,04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Geliştirilmiş Neubauer, en küçük kare | 0,0025 mm² | 0.1 mm | 0,25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal, 1 mm kare | 1 mm² | 0.2 mm | 0,2 µL | 5 × 10³ |
Faktör, seyreltmeden önce kare başına sayılan hücre başınadır. Tek kullanımlık sayım lamları genellikle 0,1 mm derinlikte geliştirilmiş Neubauer ızgarasını taklit eder; emin değilseniz lamın prospektüsüne bakın.
Bunun yerine görüntülerde hücre sayma
Hemositometre süspansiyondaki hücreleri sayar. Bir mikrografta veya tam slaytta çekirdekleri ya da hücreleri saymak için görüntü analizi kullanın: Fiji’nin Analyze Particles komutu, QuPath, CellProfiler veya çekirdekleri ve hücreleri kod yazmadan kendi bilgisayarınızda sayan ve görüntünün kalibrasyonundan mm² başına yoğunluğu bildiren SlideScope. Bkz. mikroskopi görüntülerinde hücre sayma.
Sorular
Hemositometreden mL başına hücre nasıl hesaplanır?
Kare başına sayımın ortalamasını alın, bir karenin hacmine bölün (alan × derinlik; Neubauer büyük karesi için 1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 10⁻⁴ mL) ve seyreltme faktörüyle çarpın. Neubauer büyük kareleri için bu, kare başına ortalama × 10⁴ × seyreltmedir.
Tripan mavisiyle seyreltme faktörü nedir?
Hücre süspansiyonu ile tripan mavisini eşit hacimlerde karıştırmak (örneğin 10 µL + 10 µL) konsantrasyonu yarıya indirir; bu nedenle seyreltme faktörü 2’dir. 1 hacim hücreye 4 hacim boya karışımı 5’lik bir faktördür.
Hücre canlılığı nasıl hesaplanır?
Canlılık (%) = canlı hücreler ÷ (canlı + ölü hücreler) × 100. Tripan mavisiyle canlı hücreler şeffaf kalır, ölü hücreler maviye boyanır.
Kaç kare saymalıyım?
En az 100 hücreye, ideal olarak 200 ile 400 hücreye ulaşacak kadar kare sayın; hata yaklaşık 1/√N’dir. Çoğu kültür için dört köşedeki büyük kareler yeterlidir; seyrek örnekler için dokuz karenin tümü veya her iki kamara gerekir.
Neden 10.000 ile çarpılır?
Neubauer kamarasının bir büyük karesi 0,1 µL hacim kapsar (1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 0,1 mm³). 1 mL’de bu hacimden 10.000 tane vardır; dolayısıyla kare başına hücre × 10.000 = mL başına hücre.
Bu hesaplayıcı ücretsiz mi?
Evet. Tarayıcınızda çalışır ve hiçbir yere bir şey göndermez. Aynı ekibin geliştirdiği masaüstü mikroskopi uygulaması SlideScope ise ücretsiz bir örnek kitaplığı (tüm araçlarla) ve kendi görüntüleriniz için abonelik sunan ücretli bir uygulamadır.
Kaynaklar
Sonuçlar kuramsal veya aritmetiktir; klinik ya da düzenlemeye tabi çalışmalarda bunlara güvenmeden önce cihazınızın belgeleriyle karşılaştırın.
Gerçek görüntüleriniz üzerinde ölçün
SlideScope, aralarında CZI, ND2, SVS ve LIF’in de bulunduğu 34 mikroskop ve slayt tarayıcı biçimini kendi kalibrasyonlarıyla açar; böylece uzunluklar, alanlar, hücre sayıları ve ölçek çubukları hiçbir ayar yapmadan µm cinsinden elde edilir. Tüm araçları yerleşik örneklerde ücretsiz deneyin; kendi görüntülerinizi açmak için abonelik gerekir. Kararınızı verdiniz mi? Hemen abone olun.