Contagem de células
Calculadora de hemocitômetro
Informe o que você contou na câmara e obtenha a concentração de células, a viabilidade, o número total de células e quanto de suspensão retirar. Funciona com as grades de Neubauer melhorada, Bürker e Fuchs-Rosenthal, com qualquer quadrado que você tenha contado e com qualquer diluição, incluindo a mistura 1:1 habitual com azul de tripano.
Como funciona a fórmula do hemocitômetro
Cada quadrado da grade de contagem contém um volume conhecido: sua área vezes a profundidade da câmara. Em uma câmara de Neubauer melhorada, um quadrado grande mede 1 mm × 1 mm e a câmara tem 0,1 mm de profundidade, então um quadrado grande contém 0,1 mm³, ou seja, 0,1 µL ou 10⁻⁴ mL. Dividir a contagem média por quadrado por esse volume dá células por mL; multiplicar pela diluição desfaz o efeito do corante ou do tampão que você adicionou.
células/mL = (N ÷ quadrados) ÷ (área mm² × profundidade mm) × 1000 × diluição
Exemplo resolvido: 200 células vivas nos 4 quadrados de canto, misturadas 1:1 com azul de tripano. 200 ÷ 4 = 50 células por quadrado; 50 × 10⁴ × 2 = 1,0 × 10⁶ células vivas/mL. Com mais 10 células mortas, a viabilidade é 200 ÷ 210 = 95,2 %. Para semear 500.000 células, retire 500.000 ÷ 1.000.000 = 0,5 mL.
Regras de contagem que mantêm o número confiável
- Regra das bordas: conte as células que tocam as linhas superior e esquerda de um quadrado e ignore as que tocam as linhas inferior e direita, para que nenhuma célula seja contada duas vezes.
- Conte células suficientes: o erro de contagem é de Poisson, cerca de 1/√N. 100 células dão aproximadamente ±10 %, 400 células cerca de ±5 %. Conte mais quadrados, ou as duas câmaras, quando a densidade for baixa.
- Dilua amostras muito densas: se um quadrado grande tiver mais de cerca de 100 células, elas se sobrepõem e algumas deixam de ser contadas. Dilua, conte de novo e informe o novo fator de diluição.
- Azul de tripano: uma mistura 1:1 com azul de tripano a 0,4 % equivale a um fator de diluição de 2. Conte em poucos minutos, porque as células vivas começam a absorver o corante e a viabilidade cai quanto mais tempo elas ficam paradas.
- Misture antes de carregar: as células sedimentam no tubo em segundos; pipete para cima e para baixo e depois preencha a câmara em um único movimento contínuo, sem transbordar.
Qual quadrado você contou?
| Câmara e quadrado | Área | Profundidade | Volume por quadrado | Fator (× contagem por quadrado) |
|---|---|---|---|---|
| Neubauer melhorada ou Bürker, quadrado grande | 1 mm² | 0.1 mm | 0,1 µL | 10⁴ |
| Neubauer melhorada, um dos 25 quadrados centrais | 0,04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Neubauer melhorada, menor quadrado | 0,0025 mm² | 0.1 mm | 0,25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal, quadrado de 1 mm | 1 mm² | 0.2 mm | 0,2 µL | 5 × 10³ |
O fator vale por célula contada por quadrado, antes da diluição. As lâminas de contagem descartáveis geralmente copiam a grade de Neubauer melhorada com 0,1 mm de profundidade; em caso de dúvida, consulte a bula da lâmina.
Contar células em imagens
Um hemocitômetro conta células em suspensão. Para contar núcleos ou células em uma micrografia ou em uma lâmina inteira, use análise de imagem: o Analyze Particles do Fiji, o QuPath, o CellProfiler ou o SlideScope, que conta núcleos e células no seu próprio computador sem programação e informa a densidade por mm² a partir da calibração da imagem. Veja como contar células em imagens de microscopia.
Perguntas
Como calcular células por mL com um hemocitômetro?
Calcule a média da contagem por quadrado, divida pelo volume de um quadrado (área × profundidade; para um quadrado grande de Neubauer, 1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 10⁻⁴ mL) e multiplique pelo fator de diluição. Para quadrados grandes de Neubauer, isso dá média por quadrado × 10⁴ × diluição.
Qual é o fator de diluição com azul de tripano?
Misturar volumes iguais de suspensão de células e azul de tripano (por exemplo, 10 µL + 10 µL) reduz a concentração pela metade, então o fator de diluição é 2. Uma mistura de 1 parte de células para 4 partes de corante corresponde a um fator de 5.
Como calcular a viabilidade celular?
Viabilidade (%) = células vivas ÷ (células vivas + mortas) × 100. Com azul de tripano, as células vivas continuam claras e as mortas ficam coradas de azul.
Quantos quadrados devo contar?
Conte quadrados suficientes para chegar a pelo menos 100 células, idealmente de 200 a 400; o erro é de cerca de 1/√N. Para a maioria das culturas, os quatro quadrados grandes de canto bastam; amostras esparsas exigem os nove quadrados ou as duas câmaras.
Por que multiplicar por 10.000?
Um quadrado grande de uma câmara de Neubauer contém 0,1 µL (1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 0,1 mm³). Cabem 10.000 desses volumes em 1 mL, então células por quadrado × 10.000 = células por mL.
Esta calculadora é gratuita?
Sim. Ela roda no seu navegador e não envia nada a lugar nenhum. O SlideScope, o aplicativo de microscopia para desktop feito pela mesma equipe, é um aplicativo pago com uma biblioteca de amostras gratuita (todas as ferramentas) e uma assinatura para suas próprias imagens.
Fontes
Os resultados são teóricos ou aritméticos; confira-os com a documentação do seu instrumento antes de usá-los em trabalhos clínicos ou regulamentados.
Meça nas suas imagens reais
O SlideScope abre 34 formatos de microscópios e scanners de lâminas, entre eles CZI, ND2, SVS e LIF, com a calibração de cada arquivo, então comprimentos, áreas, contagens de células e barras de escala saem em µm sem nenhuma configuração. Experimente todas as ferramentas de graça com as amostras incluídas; para abrir suas próprias imagens, é preciso uma assinatura. Já decidiu? Assine agora.