การนับเซลล์
เครื่องคำนวณฮีโมไซโตมิเตอร์
กรอกจำนวนที่คุณนับได้บนแชมเบอร์ แล้วรับค่าความเข้มข้นของเซลล์ ความมีชีวิตของเซลล์ จำนวนเซลล์ทั้งหมด และปริมาตรสารแขวนลอยเซลล์ที่ต้องใช้ ใช้ได้กับกริด improved Neubauer, Bürker และ Fuchs-Rosenthal กับช่องทุกแบบที่คุณนับ และกับทุกอัตราการเจือจาง รวมถึงการผสม trypan blue แบบ 1:1 ที่ใช้กันทั่วไป
สูตรฮีโมไซโตมิเตอร์ทำงานอย่างไร
แต่ละช่องของกริดนับมีปริมาตรที่ทราบค่า คือพื้นที่คูณความลึกของแชมเบอร์ บนแชมเบอร์ improved Neubauer ช่องใหญ่มีขนาด 1 mm × 1 mm และแชมเบอร์ลึก 0.1 mm ช่องใหญ่หนึ่งช่องจึงมีปริมาตร 0.1 mm³ ซึ่งเท่ากับ 0.1 µL หรือ 10⁻⁴ mL การหารค่าเฉลี่ยจำนวนนับต่อช่องด้วยปริมาตรนั้นจะได้จำนวนเซลล์ต่อ mL และการคูณด้วยอัตราการเจือจางจะชดเชยสีย้อมหรือบัฟเฟอร์ที่คุณเติมลงไป
เซลล์/mL = (N ÷ จำนวนช่อง) ÷ (พื้นที่ mm² × ความลึก mm) × 1000 × อัตราการเจือจาง
ตัวอย่างการคำนวณ: นับเซลล์มีชีวิตได้ 200 เซลล์จาก 4 ช่องมุม ผสมกับ trypan blue แบบ 1:1 ได้ 200 ÷ 4 = 50 เซลล์ต่อช่อง; 50 × 10⁴ × 2 = 1.0 × 10⁶ เซลล์มีชีวิต/mL หากมีเซลล์ตายอีก 10 เซลล์ ความมีชีวิตของเซลล์คือ 200 ÷ 210 = 95.2 % หากต้องการเพาะเลี้ยง 500,000 เซลล์ ให้ใช้ 500,000 ÷ 1,000,000 = 0.5 mL
กฎการนับที่ทำให้ตัวเลขถูกต้อง
- กฎขอบ: นับเซลล์ที่แตะเส้นด้านบนและด้านซ้ายของช่อง และข้ามเซลล์ที่แตะเส้นด้านล่างและด้านขวา เพื่อไม่ให้นับเซลล์ใดซ้ำสองครั้ง
- นับเซลล์ให้มากพอ: ความคลาดเคลื่อนของการนับเป็นแบบ Poisson ประมาณ 1/√N การนับ 100 เซลล์ให้ความคลาดเคลื่อนประมาณ ±10 % และ 400 เซลล์ประมาณ ±5 % เมื่อความหนาแน่นต่ำ ให้นับช่องเพิ่ม หรือนับทั้งสองแชมเบอร์
- เจือจางตัวอย่างที่หนาแน่นเกินไป: หากช่องใหญ่หนึ่งช่องมีเซลล์มากกว่าประมาณ 100 เซลล์ เซลล์จะซ้อนกันและนับตกหล่น ให้เจือจาง นับใหม่ และกรอกอัตราการเจือจางใหม่
- Trypan blue: การผสม 1:1 กับ trypan blue 0.4 % มีอัตราการเจือจางเท่ากับ 2 ให้นับภายในไม่กี่นาที เพราะเซลล์มีชีวิตจะเริ่มดูดซับสีย้อม และความมีชีวิตจะลดลงยิ่งทิ้งไว้นาน
- ผสมก่อนบรรจุ: เซลล์ตกตะกอนในหลอดภายในไม่กี่วินาที ให้ดูดปล่อยด้วยปิเปตขึ้นลง แล้วเติมแชมเบอร์ในครั้งเดียวอย่างสม่ำเสมอโดยไม่ให้ล้น
คุณนับช่องไหน
| แชมเบอร์และช่อง | พื้นที่ | ความลึก | ปริมาตรต่อช่อง | ตัวคูณ (× จำนวนนับต่อช่อง) |
|---|---|---|---|---|
| Improved Neubauer หรือ Bürker ช่องใหญ่ | 1 mm² | 0.1 mm | 0.1 µL | 10⁴ |
| Improved Neubauer หนึ่งใน 25 ช่องกลาง | 0.04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Improved Neubauer ช่องเล็กที่สุด | 0.0025 mm² | 0.1 mm | 0.25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal ช่อง 1 mm | 1 mm² | 0.2 mm | 0.2 µL | 5 × 10³ |
ตัวคูณนี้คิดต่อเซลล์ที่นับได้ต่อช่อง ก่อนคูณอัตราการเจือจาง สไลด์นับเซลล์แบบใช้แล้วทิ้งมักใช้กริดแบบ improved Neubauer ที่ความลึก 0.1 mm หากไม่แน่ใจ ให้ตรวจสอบเอกสารกำกับของสไลด์
นับเซลล์ในภาพแทน
ฮีโมไซโตมิเตอร์ใช้นับเซลล์ในสารแขวนลอย หากต้องการนับนิวเคลียสหรือเซลล์ในภาพถ่ายจากกล้องจุลทรรศน์หรือในสไลด์ทั้งแผ่น ให้ใช้การวิเคราะห์ภาพ: Analyze Particles ของ Fiji, QuPath, CellProfiler หรือ SlideScope ซึ่งนับนิวเคลียสและเซลล์บนคอมพิวเตอร์ของคุณเองโดยไม่ต้องเขียนโค้ด และรายงานความหนาแน่นต่อ mm² จากค่าการปรับเทียบของภาพ ดูวิธีนับเซลล์ในภาพจากกล้องจุลทรรศน์
คำถาม
จะคำนวณจำนวนเซลล์ต่อ mL จากฮีโมไซโตมิเตอร์ได้อย่างไร
หาค่าเฉลี่ยจำนวนนับต่อช่อง หารด้วยปริมาตรของหนึ่งช่อง (พื้นที่ × ความลึก สำหรับช่องใหญ่ของ Neubauer คือ 1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 10⁻⁴ mL) แล้วคูณด้วยอัตราการเจือจาง สำหรับช่องใหญ่ของ Neubauer จะได้ ค่าเฉลี่ยต่อช่อง × 10⁴ × อัตราการเจือจาง
อัตราการเจือจางเมื่อใช้ trypan blue คือเท่าไร
การผสมสารแขวนลอยเซลล์กับ trypan blue ในปริมาตรเท่ากัน (เช่น 10 µL + 10 µL) ทำให้ความเข้มข้นลดลงครึ่งหนึ่ง อัตราการเจือจางจึงเท่ากับ 2 การผสมเซลล์ 1 ส่วนต่อสีย้อม 4 ส่วนมีอัตราการเจือจางเท่ากับ 5
จะคำนวณความมีชีวิตของเซลล์ได้อย่างไร
ความมีชีวิต (%) = เซลล์มีชีวิต ÷ (เซลล์มีชีวิต + เซลล์ตาย) × 100 เมื่อใช้ trypan blue เซลล์มีชีวิตจะยังใส ส่วนเซลล์ตายจะติดสีน้ำเงิน
ควรนับกี่ช่อง
นับช่องให้มากพอจนได้อย่างน้อย 100 เซลล์ โดยดีที่สุดคือ 200 ถึง 400 เซลล์ ความคลาดเคลื่อนประมาณ 1/√N สำหรับการเพาะเลี้ยงส่วนใหญ่ ช่องใหญ่สี่ช่องมุมก็เพียงพอ ตัวอย่างที่เซลล์เบาบางต้องนับทั้งเก้าช่องหรือทั้งสองแชมเบอร์
ทำไมต้องคูณด้วย 10,000
ช่องใหญ่หนึ่งช่องของแชมเบอร์ Neubauer มีปริมาตร 0.1 µL (1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 0.1 mm³) ใน 1 mL มีปริมาตรขนาดนี้ 10,000 ส่วน ดังนั้น เซลล์ต่อช่อง × 10,000 = เซลล์ต่อ mL
เครื่องคำนวณนี้ใช้ฟรีหรือไม่?
ใช่ เครื่องคำนวณทำงานในเบราว์เซอร์ของคุณและไม่ส่งข้อมูลใด ๆ ออกไป ส่วน SlideScope แอปกล้องจุลทรรศน์บนเดสก์ท็อปจากทีมเดียวกัน เป็นแอปแบบชำระเงินที่มีคลังภาพตัวอย่างฟรี (ใช้ได้ทุกเครื่องมือ) และต้องสมัครสมาชิกสำหรับภาพของคุณเอง
แหล่งอ้างอิง
ผลลัพธ์เป็นค่าทางทฤษฎีหรือการคำนวณทางคณิตศาสตร์ ตรวจสอบกับเอกสารของเครื่องมือของคุณก่อนนำไปใช้กับงานทางคลินิกหรืองานที่มีการกำกับดูแล
วัดบนภาพจริงของคุณ
SlideScope เปิดไฟล์จากกล้องจุลทรรศน์และเครื่องสแกนสไลด์ได้ 34 รูปแบบ รวมถึง CZI, ND2, SVS และ LIF พร้อมการปรับเทียบของไฟล์เอง ความยาว พื้นที่ จำนวนเซลล์ และแถบมาตราส่วนจึงออกมาเป็น µm โดยไม่ต้องตั้งค่าใด ๆ ลองใช้ทุกเครื่องมือฟรีกับภาพตัวอย่างในตัว ส่วนการเปิดภาพของคุณเองต้องใช้การสมัครสมาชิก ตัดสินใจแล้ว? สมัครสมาชิกเลย