Liczenie komórek
Kalkulator hemocytometru
Wpisz, co zliczyłeś w komorze, i otrzymaj stężenie komórek, żywotność, całkowitą liczbę komórek oraz objętość zawiesiny do pobrania. Kalkulator działa dla siatek Neubauera improved, Bürkera i Fuchsa-Rosenthala, dla dowolnych zliczonych kwadratów i dowolnego rozcieńczenia, w tym typowego mieszania 1:1 z błękitem trypanu.
Jak działa wzór hemocytometru
Każdy kwadrat siatki zliczeniowej obejmuje znaną objętość: jego pole pomnożone przez głębokość komory. W komorze Neubauera improved duży kwadrat ma wymiary 1 mm × 1 mm, a komora ma głębokość 0,1 mm, więc duży kwadrat obejmuje 0,1 mm³, czyli 0,1 µL lub 10⁻⁴ mL. Podzielenie średniej liczby komórek na kwadrat przez tę objętość daje liczbę komórek na mL; pomnożenie przez rozcieńczenie znosi efekt dodanego barwnika lub buforu.
komórki/mL = (N ÷ kwadraty) ÷ (pole mm² × głębokość mm) × 1000 × rozcieńczenie
Przykład obliczenia: 200 żywych komórek w 4 narożnych kwadratach, zmieszanych 1:1 z błękitem trypanu. 200 ÷ 4 = 50 komórek na kwadrat; 50 × 10⁴ × 2 = 1,0 × 10⁶ żywych komórek/mL. Jeśli zliczono też 10 martwych komórek, żywotność wynosi 200 ÷ 210 = 95,2%. Aby wysiać 500 000 komórek, pobierz 500 000 ÷ 1 000 000 = 0,5 mL.
Zasady zliczania, dzięki którym wynik jest rzetelny
- Zasada krawędzi: licz komórki dotykające górnej i lewej linii kwadratu, a pomijaj te dotykające dolnej i prawej, aby żadna komórka nie została policzona dwa razy.
- Zlicz wystarczająco dużo komórek: błąd zliczenia ma rozkład Poissona i wynosi około 1/√N. 100 komórek daje mniej więcej ±10%, 400 komórek około ±5%. Przy małej gęstości licz więcej kwadratów albo obie komory.
- Rozcieńczaj zbyt gęste próbki: jeśli w dużym kwadracie jest więcej niż około 100 komórek, komórki nakładają się na siebie i część zostaje pominięta. Rozcieńcz, policz ponownie i wpisz nowy współczynnik rozcieńczenia.
- Błękit trypanu: mieszanie 1:1 z 0,4% błękitem trypanu oznacza współczynnik rozcieńczenia 2. Licz w ciągu kilku minut, ponieważ żywe komórki zaczynają pochłaniać barwnik i żywotność spada, im dłużej stoją.
- Wymieszaj przed nałożeniem: komórki opadają w probówce w ciągu kilku sekund; kilka razy zassij i wypuść zawiesinę pipetą, a następnie napełnij komorę jednym płynnym ruchem, bez jej przepełniania.
Który kwadrat zliczyłeś?
| Komora i kwadrat | Pole | Głębokość | Objętość na kwadrat | Współczynnik (× liczba na kwadrat) |
|---|---|---|---|---|
| Neubauer improved lub Bürker, duży kwadrat | 1 mm² | 0.1 mm | 0,1 µL | 10⁴ |
| Neubauer improved, jeden z 25 kwadratów środkowych | 0,04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Neubauer improved, najmniejszy kwadrat | 0,0025 mm² | 0.1 mm | 0,25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal, kwadrat 1 mm | 1 mm² | 0.2 mm | 0,2 µL | 5 × 10³ |
Współczynnik dotyczy jednej komórki zliczonej na kwadrat, przed uwzględnieniem rozcieńczenia. Jednorazowe szkiełka do liczenia zwykle powielają siatkę Neubauera improved przy głębokości 0,1 mm; w razie wątpliwości sprawdź ulotkę szkiełka.
Liczenie komórek na obrazach
Hemocytometr liczy komórki w zawiesinie. Aby policzyć jądra lub komórki na mikrofotografii lub całym preparacie, użyj analizy obrazu: Analyze Particles w Fiji, QuPath, CellProfiler albo SlideScope, który liczy jądra i komórki na Twoim komputerze bez kodu i podaje gęstość na mm² na podstawie kalibracji obrazu. Zobacz, jak liczyć komórki na obrazach mikroskopowych.
Pytania
Jak obliczyć liczbę komórek na mL z hemocytometru?
Uśrednij liczbę komórek na kwadrat, podziel ją przez objętość jednego kwadratu (pole × głębokość; dla dużego kwadratu Neubauera 1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 10⁻⁴ mL) i pomnóż przez współczynnik rozcieńczenia. Dla dużych kwadratów Neubauera daje to średnia na kwadrat × 10⁴ × rozcieńczenie.
Jaki jest współczynnik rozcieńczenia przy błękicie trypanu?
Zmieszanie równych objętości zawiesiny komórek i błękitu trypanu (na przykład 10 µL + 10 µL) zmniejsza stężenie o połowę, więc współczynnik rozcieńczenia wynosi 2. Mieszanina 1 części komórek na 4 części barwnika to współczynnik 5.
Jak obliczyć żywotność komórek?
Żywotność (%) = żywe komórki ÷ (żywe + martwe komórki) × 100. Przy błękicie trypanu żywe komórki pozostają jasne, a martwe barwią się na niebiesko.
Ile kwadratów powinienem zliczyć?
Zlicz tyle kwadratów, aby uzyskać co najmniej 100 komórek, najlepiej od 200 do 400; błąd wynosi około 1/√N. Dla większości hodowli wystarczą cztery narożne duże kwadraty; rzadkie próbki wymagają zliczenia wszystkich dziewięciu albo obu komór.
Dlaczego mnoży się przez 10 000?
Jeden duży kwadrat komory Neubauera obejmuje 0,1 µL (1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 0,1 mm³). W 1 mL mieści się 10 000 takich objętości, więc komórki na kwadrat × 10 000 = komórki na mL.
Czy ten kalkulator jest bezpłatny?
Tak. Działa w Twojej przeglądarce internetowej i nigdzie niczego nie wysyła. SlideScope, desktopowa aplikacja mikroskopowa tego samego zespołu, to płatna aplikacja z bezpłatną biblioteką przykładów (wszystkie narzędzia) i subskrypcją na własne obrazy.
Źródła
Wyniki są teoretyczne lub arytmetyczne; zanim oprzesz się na nich w pracy klinicznej lub regulowanej, sprawdź je w dokumentacji swojego przyrządu.
Mierz na swoich prawdziwych obrazach
SlideScope otwiera 34 formaty mikroskopów i skanerów preparatów, w tym CZI, ND2, SVS i LIF, z ich własną kalibracją, więc długości, pola powierzchni, liczby komórek i paski skali wychodzą w µm bez żadnej konfiguracji. Wypróbuj wszystkie narzędzia bezpłatnie na wbudowanych przykładach; do otwierania własnych obrazów potrzebna jest subskrypcja. Już zdecydowane? Subskrybuj teraz.