कोशिका गणना
हीमोसाइटोमीटर कैलकुलेटर
चैंबर पर आपने जो गिना, वह दर्ज करें और कोशिका सांद्रता, जीवनक्षमता (viability), कोशिकाओं की कुल संख्या और कितना सस्पेंशन लेना है, यह जानें। यह improved Neubauer, Bürker और Fuchs-Rosenthal ग्रिड के लिए, आपके गिने किसी भी वर्ग के लिए, और किसी भी डाइल्यूशन के लिए काम करता है, जिसमें आम 1:1 ट्रिपैन ब्लू मिश्रण भी शामिल है।
हीमोसाइटोमीटर फ़ॉर्मूला कैसे काम करता है
काउंटिंग ग्रिड के हर वर्ग में एक ज्ञात आयतन होता है: उसका क्षेत्रफल गुणा चैंबर की गहराई। improved Neubauer चैंबर पर एक बड़ा वर्ग 1 mm × 1 mm का होता है और चैंबर 0.1 mm गहरा होता है, इसलिए एक बड़े वर्ग में 0.1 mm³ आता है, जो 0.1 µL या 10⁻⁴ mL है। प्रति वर्ग औसत गणना को इस आयतन से भाग देने पर कोशिकाएँ प्रति mL मिलती हैं; डाइल्यूशन से गुणा करने पर आपके मिलाए डाई या बफ़र का असर हट जाता है।
कोशिकाएँ/mL = (N ÷ वर्ग) ÷ (क्षेत्रफल mm² × गहराई mm) × 1000 × डाइल्यूशन
हल किया हुआ उदाहरण: 4 कोने वाले वर्गों में 200 जीवित कोशिकाएँ, ट्रिपैन ब्लू के साथ 1:1 मिलाई गईं। 200 ÷ 4 = प्रति वर्ग 50 कोशिकाएँ; 50 × 10⁴ × 2 = 1.0 × 10⁶ जीवित कोशिकाएँ/mL। साथ में 10 मृत कोशिकाएँ भी हों, तो जीवनक्षमता 200 ÷ 210 = 95.2 % है। 500,000 कोशिकाएँ सीड करने के लिए 500,000 ÷ 1,000,000 = 0.5 mL लें।
गिनती के नियम जो संख्या को सही रखते हैं
- किनारे का नियम: वर्ग की ऊपरी और बाईं रेखाओं को छूने वाली कोशिकाएँ गिनें और निचली व दाईं रेखाओं को छूने वाली छोड़ दें, ताकि कोई कोशिका दो बार न गिनी जाए।
- पर्याप्त कोशिकाएँ गिनें: गणना त्रुटि Poisson होती है, लगभग 1/√N। 100 कोशिकाओं पर लगभग ±10 %, 400 कोशिकाओं पर लगभग ±5 %। जब घनत्व कम हो, तो ज़्यादा वर्ग, या दोनों चैंबर गिनें।
- घने सैंपल को डाइल्यूट करें: अगर एक बड़े वर्ग में लगभग 100 से ज़्यादा कोशिकाएँ हों, तो कोशिकाएँ एक-दूसरे पर चढ़ जाती हैं और छूट जाती हैं। डाइल्यूट करें, फिर से गिनें, और नया डाइल्यूशन फ़ैक्टर दर्ज करें।
- ट्रिपैन ब्लू: 0.4 % ट्रिपैन ब्लू के साथ 1:1 मिश्रण का डाइल्यूशन फ़ैक्टर 2 होता है। कुछ ही मिनटों में गिन लें, क्योंकि जीवित कोशिकाएँ डाई सोखने लगती हैं और जितनी देर वे पड़ी रहती हैं, जीवनक्षमता उतनी घटती जाती है।
- लोड करने से पहले मिलाएँ: ट्यूब में कोशिकाएँ कुछ ही सेकंड में नीचे बैठ जाती हैं; पिपेट से ऊपर-नीचे करें, फिर बिना ज़्यादा भरे एक ही सहज स्ट्रोक में चैंबर भरें।
आपने कौन-सा वर्ग गिना?
| चैंबर और वर्ग | क्षेत्रफल | गहराई | प्रति वर्ग आयतन | फ़ैक्टर (× प्रति वर्ग गणना) |
|---|---|---|---|---|
| Improved Neubauer या Bürker, बड़ा वर्ग | 1 mm² | 0.1 mm | 0.1 µL | 10⁴ |
| Improved Neubauer, 25 केंद्रीय वर्गों में से एक | 0.04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Improved Neubauer, सबसे छोटा वर्ग | 0.0025 mm² | 0.1 mm | 0.25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal, 1 mm वर्ग | 1 mm² | 0.2 mm | 0.2 µL | 5 × 10³ |
फ़ैक्टर प्रति वर्ग गिनी गई प्रति कोशिका के लिए है, डाइल्यूशन से पहले। डिस्पोज़ेबल काउंटिंग स्लाइड आमतौर पर 0.1 mm गहराई पर improved Neubauer ग्रिड की नकल करती हैं; संदेह हो तो स्लाइड के साथ आया पर्चा देखें।
इसके बजाय इमेज में कोशिकाएँ गिनना
हीमोसाइटोमीटर सस्पेंशन में कोशिकाएँ गिनता है। किसी माइक्रोग्राफ़ या होल स्लाइड में न्यूक्लियाई या कोशिकाएँ गिनने के लिए इमेज विश्लेषण का उपयोग करें: Fiji का Analyze Particles, QuPath, CellProfiler, या SlideScope, जो बिना कोड के आपके अपने कंप्यूटर पर न्यूक्लियाई और कोशिकाएँ गिनता है और इमेज के कैलिब्रेशन से प्रति mm² घनत्व बताता है। देखें माइक्रोस्कोपी इमेज में कोशिकाएँ कैसे गिनें।
प्रश्न
हीमोसाइटोमीटर से कोशिकाएँ प्रति mL कैसे निकालें?
प्रति वर्ग गणना का औसत लें, उसे एक वर्ग के आयतन से भाग दें (क्षेत्रफल × गहराई, Neubauer के बड़े वर्ग के लिए 1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 10⁻⁴ mL) और डाइल्यूशन फ़ैक्टर से गुणा करें। Neubauer के बड़े वर्गों के लिए यह है प्रति वर्ग औसत × 10⁴ × डाइल्यूशन।
ट्रिपैन ब्लू के साथ डाइल्यूशन फ़ैक्टर क्या होता है?
सेल सस्पेंशन और ट्रिपैन ब्लू के बराबर आयतन (उदाहरण के लिए 10 µL + 10 µL) मिलाने से सांद्रता आधी हो जाती है, इसलिए डाइल्यूशन फ़ैक्टर 2 है। 1 भाग कोशिकाएँ और 4 भाग डाई वाले मिश्रण का फ़ैक्टर 5 होता है।
कोशिका जीवनक्षमता कैसे निकालें?
जीवनक्षमता (%) = जीवित कोशिकाएँ ÷ (जीवित + मृत कोशिकाएँ) × 100। ट्रिपैन ब्लू के साथ जीवित कोशिकाएँ पारदर्शी रहती हैं और मृत कोशिकाएँ नीली रंग जाती हैं।
मुझे कितने वर्ग गिनने चाहिए?
इतने वर्ग गिनें कि कम से कम 100 कोशिकाएँ हो जाएँ, आदर्श रूप से 200 से 400; त्रुटि लगभग 1/√N होती है। अधिकांश कल्चर के लिए चार कोने वाले बड़े वर्ग काफ़ी हैं; विरल सैंपल के लिए सभी नौ या दोनों चैंबर चाहिए।
10,000 से गुणा क्यों करते हैं?
Neubauer चैंबर के एक बड़े वर्ग में 0.1 µL आता है (1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 0.1 mm³)। 1 mL में ऐसे 10,000 आयतन होते हैं, इसलिए प्रति वर्ग कोशिकाएँ × 10,000 = कोशिकाएँ प्रति mL।
क्या यह कैलकुलेटर मुफ़्त है?
हाँ। यह आपके ब्राउज़र में चलता है और कहीं कुछ नहीं भेजता। SlideScope, उसी टीम का बनाया डेस्कटॉप माइक्रोस्कोपी ऐप, एक पेड ऐप है जिसके साथ मुफ़्त सैंपल लाइब्रेरी (हर टूल के साथ) मिलती है और आपकी अपनी इमेज के लिए सदस्यता लेनी होती है।
स्रोत
परिणाम सैद्धांतिक या अंकगणितीय हैं; क्लिनिकल या विनियमित काम में इन पर भरोसा करने से पहले इन्हें अपने उपकरण के दस्तावेज़ों से मिलाकर जाँच लें।
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