ספירת תאים
מחשבון המוציטומטר
הזינו את מה שספרתם בתא הספירה וקבלו את ריכוז התאים, החיוּת, המספר הכולל של התאים וכמה תרחיף לקחת. המחשבון מתאים לרשתות Neubauer משופר, Bürker ו-Fuchs-Rosenthal, לכל ריבוע שספרתם ולכל מיהול, כולל ערבוב 1:1 הרגיל עם טריפן בלו.
איך עובדת הנוסחה של ההמוציטומטר
כל ריבוע ברשת הספירה מכיל נפח ידוע: השטח שלו כפול עומק התא. בתא Neubauer משופר ריבוע גדול הוא 1 mm × 1 mm ועומק התא 0.1 mm, כך שריבוע גדול מכיל 0.1 mm³, כלומר 0.1 µL או 10⁻⁴ mL. חלוקת הספירה הממוצעת לריבוע בנפח הזה נותנת תאים למ"ל; הכפלה במיהול מבטלת את הצבע או הבופר שהוספתם.
תאים/mL = (N ÷ ריבועים) ÷ (שטח mm² × עומק mm) × 1000 × מיהול
דוגמה פתורה: 200 תאים חיים ב-4 הריבועים הפינתיים, מעורבבים 1:1 עם טריפן בלו. 200 ÷ 4 = 50 תאים לריבוע; 50 × 10⁴ × 2 = 1.0 × 10⁶ תאים חיים/mL. אם נספרו גם 10 תאים מתים, החיוּת היא 200 ÷ 210 = 95.2 %. כדי לזרוע 500,000 תאים, קחו 500,000 ÷ 1,000,000 = 0.5 mL.
כללי ספירה ששומרים על מספר אמין
- כלל הקצוות: ספרו תאים שנוגעים בקווים העליון והשמאלי של ריבוע ודלגו על אלה שנוגעים בתחתון ובימני, כך שאף תא לא נספר פעמיים.
- ספרו מספיק תאים: שגיאת הספירה היא פואסונית, בערך 1/√N. 100 תאים נותנים בערך ±10 %, 400 תאים בערך ±5 %. כשהצפיפות נמוכה, ספרו יותר ריבועים, או את שני התאים.
- מהלו דגימות צפופות: אם ריבוע גדול מכיל יותר מכ-100 תאים, התאים חופפים ומתפספסים. מהלו, ספרו מחדש והזינו את מקדם המיהול החדש.
- טריפן בלו: ערבוב 1:1 עם טריפן בלו 0.4 % הוא מקדם מיהול של 2. ספרו בתוך כמה דקות, כי תאים חיים מתחילים לקלוט את הצבע והחיוּת יורדת ככל שהם ממתינים יותר.
- ערבבו לפני הטעינה: תאים שוקעים במבחנה תוך שניות; פפטו למעלה ולמטה, ואז מלאו את התא בתנועה חלקה אחת בלי למלא יתר על המידה.
איזה ריבוע ספרתם?
| תא ספירה וריבוע | שטח | עומק | נפח לריבוע | מקדם (× ספירה לריבוע) |
|---|---|---|---|---|
| Neubauer משופר או Bürker, ריבוע גדול | 1 mm² | 0.1 mm | 0.1 µL | 10⁴ |
| Neubauer משופר, אחד מ-25 הריבועים המרכזיים | 0.04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Neubauer משופר, הריבוע הקטן ביותר | 0.0025 mm² | 0.1 mm | 0.25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal, ריבוע של 1 mm | 1 mm² | 0.2 mm | 0.2 µL | 5 × 10³ |
המקדם הוא לכל תא שנספר בריבוע, לפני המיהול. שקופיות ספירה חד-פעמיות מעתיקות בדרך כלל את רשת ה-Neubauer המשופר בעומק 0.1 mm; אם יש ספק, בדקו בעלון המצורף לשקופית.
ספירת תאים בתמונות במקום זאת
המוציטומטר סופר תאים בתרחיף. כדי לספור גרעינים או תאים במיקרוגרף או בשקופית שלמה, השתמשו בניתוח תמונה: Analyze Particles של Fiji, QuPath, CellProfiler, או SlideScope, שסופר גרעינים ותאים במחשב שלכם בלי קוד ומדווח על צפיפות למ"מ² לפי הכיול של התמונה. ראו איך לספור תאים בתמונות מיקרוסקופיה.
שאלות
איך מחשבים תאים למ"ל מהמוציטומטר?
חשבו את הספירה הממוצעת לריבוע, חלקו בנפח של ריבוע אחד (שטח × עומק; בריבוע גדול של Neubauer 1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 10⁻⁴ mL) והכפילו במקדם המיהול. בריבועים גדולים של Neubauer זה ממוצע לריבוע × 10⁴ × מיהול.
מהו מקדם המיהול עם טריפן בלו?
ערבוב נפחים שווים של תרחיף תאים וטריפן בלו (למשל 10 µL + 10 µL) מחצה את הריכוז, ולכן מקדם המיהול הוא 2. ערבוב של חלק אחד תאים לארבעה חלקים צבע הוא מקדם של 5.
איך מחשבים חיוּת תאים?
חיוּת (%) = תאים חיים ÷ (תאים חיים + מתים) × 100. עם טריפן בלו, תאים חיים נשארים שקופים ותאים מתים נצבעים בכחול.
כמה ריבועים כדאי לספור?
ספרו מספיק ריבועים כדי להגיע לפחות ל-100 תאים, ובאופן אידיאלי ל-200 עד 400; השגיאה היא בערך 1/√N. ברוב התרביות ארבעת הריבועים הגדולים הפינתיים מספיקים; דגימות דלילות דורשות את כל התשעה או את שני התאים.
למה מכפילים ב-10,000?
ריבוע גדול אחד בתא Neubauer מכיל 0.1 µL (1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 0.1 mm³). ב-1 mL יש 10,000 נפחים כאלה, ולכן תאים לריבוע × 10,000 = תאים למ"ל.
האם המחשבון הזה חינמי?
כן. הוא רץ בדפדפן שלכם ולא שולח דבר לשום מקום. SlideScope, אפליקציית המיקרוסקופיה למחשב של אותו צוות, היא אפליקציה בתשלום עם ספריית דוגמאות חינמית (כל הכלים) ומנוי לתמונות שלכם.
מקורות
התוצאות תיאורטיות או חשבוניות; בדקו אותן מול התיעוד של המכשיר שלכם לפני שתסתמכו עליהן בעבודה קלינית או מפוקחת.
מדדו על התמונות האמיתיות שלכם
SlideScope פותח 34 פורמטים של מיקרוסקופים וסורקי שקופיות, ביניהם CZI, ND2, SVS ו-LIF, עם הכיול שלהם, כך שאורכים, שטחים, ספירות תאים ופסי קנה מידה מתקבלים ב-µm בלי להגדיר דבר. נסו כל כלי בחינם על הדוגמאות המובנות; כדי לפתוח את התמונות שלכם נדרש מנוי. כבר החלטתם? הירשמו למנוי עכשיו.