血球計算盤の計算式のしくみ
計数グリッドの各区画には既知の容積があり、それは区画の面積にチャンバーの深さを掛けたものです。改良ノイバウエル計算盤では大区画が 1 mm × 1 mm、チャンバーの深さが 0.1 mm なので、大区画 1 つの容積は 0.1 mm³、つまり 0.1 µL（10⁻⁴ mL）です。区画あたりの平均カウントをこの容積で割ると mL あたりの細胞数が得られ、希釈倍率を掛けることで加えた色素や緩衝液の分を戻します。
細胞数/mL = (N ÷ 区画数) ÷ (面積 mm² × 深さ mm) × 1000 × 希釈倍率
計算例：隅の 4 区画で生細胞 200 個、トリパンブルーと 1:1 で混合。200 ÷ 4 = 区画あたり 50 個の細胞。50 × 10⁴ × 2 = 1.0 × 10⁶ 生細胞/mL。死細胞も 10 個あった場合、生存率は 200 ÷ 210 = 95.2 % です。500,000 個の細胞を播種するには、500,000 ÷ 1,000,000 = 0.5 mL を採取します。
正確な数値を得るための計数ルール
- 境界線のルール：区画の上辺と左辺の線に触れている細胞は数え、下辺と右辺に触れている細胞は数えません。こうすれば同じ細胞を 2 回数えることがありません。
- 十分な数の細胞を数える：計数誤差はポアソン分布に従い、約 1/√N です。100 個なら約 ±10 %、400 個なら約 ±5 % になります。密度が低い場合は、より多くの区画、または両方のチャンバーを数えてください。
- 混み合ったサンプルは希釈する：大区画 1 つに約 100 個を超える細胞があると、細胞が重なって数え漏れが生じます。希釈して数え直し、新しい希釈倍率を入力してください。
- トリパンブルー：0.4 % トリパンブルーとの 1:1 混合は希釈倍率 2 です。数分以内にカウントしてください。時間が経つほど生細胞も色素を取り込み始め、生存率が下がります。
- 充填前に混ぜる：細胞はチューブ内で数秒のうちに沈みます。ピペッティングで混ぜてから、あふれさせないように 1 回のなめらかな動作でチャンバーを満たしてください。
どの区画をカウントしましたか？
| 計算盤と区画 | 面積 | 深さ | 区画あたりの容積 | 係数（× 区画あたりのカウント） |
|---|---|---|---|---|
| 改良ノイバウエルまたはビュルカー、大区画 | 1 mm² | 0.1 mm | 0.1 µL | 10⁴ |
| 改良ノイバウエル、中央の 25 区画のうちの 1 つ | 0.04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| 改良ノイバウエル、最小区画 | 0.0025 mm² | 0.1 mm | 0.25 nL | 4 × 10⁶ |
| フックス・ローゼンタール、1 mm 区画 | 1 mm² | 0.2 mm | 0.2 µL | 5 × 10³ |
係数は、希釈前の、区画あたりにカウントした細胞 1 個に対する値です。使い捨ての計数スライドは通常、深さ 0.1 mm の改良ノイバウエルのグリッドを採用しています。不明な場合はスライドの添付文書をご確認ください。
画像で細胞を数える場合
血球計算盤は懸濁液中の細胞を数えるものです。顕微鏡写真や全スライド画像で核や細胞を数えるには画像解析を使います。Fiji の Analyze Particles、QuPath、CellProfiler、または SlideScope です。SlideScope はコードを書かずにお使いのコンピューター上で核や細胞を計数し、画像のキャリブレーションに基づいて mm² あたりの密度を報告します。顕微鏡画像で細胞を数える方法をご覧ください。
質問
血球計算盤から mL あたりの細胞数はどう計算しますか？
区画あたりのカウントを平均し、区画 1 つの容積（面積 × 深さ。ノイバウエルの大区画なら 1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 10⁻⁴ mL）で割り、希釈倍率を掛けます。ノイバウエルの大区画なら、区画あたりの平均 × 10⁴ × 希釈倍率です。
トリパンブルーを使うときの希釈倍率はいくつですか？
細胞懸濁液とトリパンブルーを等量（たとえば 10 µL + 10 µL）混ぜると濃度が半分になるため、希釈倍率は 2 です。細胞 1 に対して色素 4 の割合で混ぜた場合は 5 になります。
細胞の生存率はどう計算しますか？
生存率 (%) = 生細胞数 ÷ (生細胞数 + 死細胞数) × 100。トリパンブルーでは、生細胞は透明のままで、死細胞は青く染まります。
いくつの区画を数えればよいですか？
少なくとも 100 個、理想的には 200～400 個の細胞に達するまで区画を数えてください。誤差は約 1/√N です。ほとんどの培養では隅の大区画 4 つで十分ですが、まばらなサンプルでは 9 区画すべてか両方のチャンバーを数える必要があります。
なぜ 10,000 を掛けるのですか？
ノイバウエル計算盤の大区画 1 つの容積は 0.1 µL です（1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 0.1 mm³）。1 mL にはこの容積が 10,000 個分あるため、区画あたりの細胞数 × 10,000 = mL あたりの細胞数になります。
この計算ツールは無料ですか？
はい。ブラウザー内で動作し、どこにもデータを送信しません。同じチームが開発したデスクトップ顕微鏡アプリ SlideScope は、無料のサンプルライブラリ（全ツール利用可）が付属する有料アプリで、ご自身の画像にはサブスクリプションが必要です。
出典
- Abcam — Counting cells using a hemocytometer（血球計算盤を使った細胞計数）
- Thermo Fisher — Useful numbers for cell culture（細胞培養に役立つ数値）
結果は理論値または計算値です。臨床業務や規制対象の業務で用いる前に、お使いの機器の資料と照らし合わせて確認してください。
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SlideScope は CZI、ND2、SVS、LIF を含む 34 種類の顕微鏡・スライドスキャナー形式を、それぞれの校正情報とともに開くため、長さ、面積、細胞数、スケールバーを設定なしで µm 単位で得られます。内蔵サンプルですべてのツールを無料でお試しいただけます。ご自身の画像を開くにはサブスクリプションが必要です。もうお決まりですか？今すぐ登録。