Contagem de células
Calculadora de hemocitómetro
Introduza o que contou na câmara e obtenha a concentração celular, a viabilidade, o número total de células e o volume de suspensão a retirar. Funciona com as grelhas Neubauer melhorada, Bürker e Fuchs-Rosenthal, com qualquer quadrado que tenha contado e com qualquer diluição, incluindo a habitual mistura 1:1 com azul de tripano.
Como funciona a fórmula do hemocitómetro
Cada quadrado da grelha de contagem contém um volume conhecido: a sua área multiplicada pela profundidade da câmara. Numa câmara de Neubauer melhorada, um quadrado grande mede 1 mm × 1 mm e a câmara tem 0,1 mm de profundidade, por isso um quadrado grande contém 0,1 mm³, ou seja, 0,1 µL ou 10⁻⁴ mL. Dividir a contagem média por quadrado por esse volume dá as células por mL; multiplicar pela diluição anula o corante ou o tampão que adicionou.
células/mL = (N ÷ quadrados) ÷ (área mm² × profundidade mm) × 1000 × diluição
Exemplo resolvido: 200 células vivas nos 4 quadrados de canto, misturadas 1:1 com azul de tripano. 200 ÷ 4 = 50 células por quadrado; 50 × 10⁴ × 2 = 1,0 × 10⁶ células vivas/mL. Com mais 10 células mortas, a viabilidade é 200 ÷ 210 = 95,2 %. Para semear 500 000 células, retire 500 000 ÷ 1 000 000 = 0,5 mL.
Regras de contagem que mantêm o número fiável
- Regra das margens: conte as células que tocam nas linhas superior e esquerda de um quadrado e ignore as que tocam nas linhas inferior e direita, para que nenhuma célula seja contada duas vezes.
- Conte células suficientes: o erro de contagem segue uma distribuição de Poisson, de cerca de 1/√N. 100 células dão aproximadamente ±10 %, 400 células cerca de ±5 %. Conte mais quadrados, ou as duas câmaras, quando a densidade é baixa.
- Dilua amostras demasiado densas: se um quadrado grande tiver mais de cerca de 100 células, as células sobrepõem-se e algumas escapam à contagem. Dilua, volte a contar e introduza o novo fator de diluição.
- Azul de tripano: uma mistura 1:1 com azul de tripano a 0,4 % corresponde a um fator de diluição de 2. Conte em poucos minutos, porque as células vivas começam a absorver o corante e a viabilidade desce quanto mais tempo ficam em repouso.
- Misture antes de carregar: as células depositam-se no tubo em segundos; pipete para cima e para baixo e depois encha a câmara num único movimento suave, sem a encher em excesso.
Que quadrado contou?
| Câmara e quadrado | Área | Profundidade | Volume por quadrado | Fator (× contagem por quadrado) |
|---|---|---|---|---|
| Neubauer melhorada ou Bürker, quadrado grande | 1 mm² | 0.1 mm | 0,1 µL | 10⁴ |
| Neubauer melhorada, um dos 25 quadrados centrais | 0,04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Neubauer melhorada, quadrado mais pequeno | 0,0025 mm² | 0.1 mm | 0,25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal, quadrado de 1 mm | 1 mm² | 0.2 mm | 0,2 µL | 5 × 10³ |
O fator aplica-se por célula contada por quadrado, antes da diluição. As lâminas de contagem descartáveis copiam normalmente a grelha Neubauer melhorada com 0,1 mm de profundidade; em caso de dúvida, consulte o folheto da lâmina.
Contar células em imagens
Um hemocitómetro conta células em suspensão. Para contar núcleos ou células numa micrografia ou numa lâmina inteira, use análise de imagem: o Analyze Particles do Fiji, o QuPath, o CellProfiler ou o SlideScope, que conta núcleos e células no seu próprio computador sem código e indica a densidade por mm² a partir da calibração da imagem. Veja como contar células em imagens de microscopia.
Perguntas
Como se calculam as células por mL a partir de um hemocitómetro?
Calcule a média da contagem por quadrado, divida pelo volume de um quadrado (área × profundidade; para um quadrado grande de Neubauer, 1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 10⁻⁴ mL) e multiplique pelo fator de diluição. Para quadrados grandes de Neubauer, isto dá média por quadrado × 10⁴ × diluição.
Qual é o fator de diluição com azul de tripano?
Misturar volumes iguais de suspensão celular e azul de tripano (por exemplo 10 µL + 10 µL) reduz a concentração para metade, por isso o fator de diluição é 2. Uma mistura de 1 parte de células para 4 partes de corante corresponde a um fator de 5.
Como se calcula a viabilidade celular?
Viabilidade (%) = células vivas ÷ (células vivas + mortas) × 100. Com azul de tripano, as células vivas ficam claras e as mortas coram de azul.
Quantos quadrados devo contar?
Conte quadrados suficientes para chegar a pelo menos 100 células, idealmente 200 a 400; o erro é de cerca de 1/√N. Para a maioria das culturas, os quatro quadrados grandes dos cantos chegam; amostras pouco densas precisam dos nove ou das duas câmaras.
Porque se multiplica por 10 000?
Um quadrado grande de uma câmara de Neubauer contém 0,1 µL (1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 0,1 mm³). Em 1 mL cabem 10 000 desses volumes, por isso células por quadrado × 10 000 = células por mL.
Esta calculadora é gratuita?
Sim. Funciona no seu navegador e não envia nada para lado nenhum. O SlideScope, a aplicação de microscopia para computador da mesma equipa, é uma aplicação paga com uma biblioteca de amostras gratuita (todas as ferramentas) e uma subscrição para as suas próprias imagens.
Fontes
Os resultados são teóricos ou aritméticos; confronte-os com a documentação do seu instrumento antes de confiar neles para trabalho clínico ou regulamentado.
Meça nas suas imagens reais
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