혈구계 공식의 원리
계수 격자의 각 정사각형은 정해진 부피, 즉 면적에 계수판 깊이를 곱한 부피를 담습니다. 개량형 Neubauer 계수판에서 큰 정사각형은 1 mm × 1 mm이고 깊이는 0.1 mm이므로, 큰 정사각형 하나는 0.1 mm³, 즉 0.1 µL 또는 10⁻⁴ mL를 담습니다. 정사각형당 평균 계수값을 이 부피로 나누면 mL당 세포 수가 나오고, 희석 배수를 곱하면 첨가한 염료나 버퍼에 의한 희석이 보정됩니다.
cells/mL = (N ÷ 정사각형 수) ÷ (면적 mm² × 깊이 mm) × 1000 × 희석 배수
계산 예시: 모서리 정사각형 4개에서 생세포 200개, 트리판 블루와 1:1로 혼합. 200 ÷ 4 = 정사각형당 세포 50개, 50 × 10⁴ × 2 = 1.0 × 10⁶ live cells/mL. 사세포도 10개였다면 생존율은 200 ÷ 210 = 95.2 %입니다. 세포 500,000개를 시딩하려면 500,000 ÷ 1,000,000 = 0.5 mL를 취합니다.
정확한 계수를 위한 규칙
- 경계선 규칙: 정사각형의 위쪽과 왼쪽 선에 닿은 세포는 세고 아래쪽과 오른쪽 선에 닿은 세포는 건너뛰어, 같은 세포를 두 번 세지 않도록 합니다.
- 충분한 수의 세포 세기: 계수 오차는 Poisson 분포를 따르며 약 1/√N입니다. 세포 100개면 약 ±10 %, 400개면 약 ±5 %입니다. 밀도가 낮으면 더 많은 정사각형을 세거나 두 챔버를 모두 세세요.
- 밀집된 시료는 희석하기: 큰 정사각형 하나에 세포가 약 100개를 넘으면 세포가 겹쳐 놓치게 됩니다. 희석해서 다시 세고, 새 희석 배수를 입력하세요.
- 트리판 블루: 0.4 % 트리판 블루와 1:1로 섞으면 희석 배수는 2입니다. 몇 분 안에 세세요. 시간이 지날수록 생세포도 염료를 흡수하기 시작해 생존율이 떨어집니다.
- 주입 전에 섞기: 세포는 튜브 안에서 몇 초 만에 가라앉습니다. 피펫으로 위아래로 섞은 다음, 넘치지 않게 한 번에 부드럽게 계수판을 채우세요.
어떤 정사각형을 셌나요?
| 계수판과 정사각형 | 면적 | 깊이 | 정사각형당 부피 | 계수 인자(× 정사각형당 계수값) |
|---|---|---|---|---|
| 개량형 Neubauer 또는 Bürker, 큰 정사각형 | 1 mm² | 0.1 mm | 0.1 µL | 10⁴ |
| 개량형 Neubauer, 중앙 정사각형 25개 중 하나 | 0.04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| 개량형 Neubauer, 가장 작은 정사각형 | 0.0025 mm² | 0.1 mm | 0.25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal, 1 mm 정사각형 | 1 mm² | 0.2 mm | 0.2 µL | 5 × 10³ |
계수 인자는 희석 전, 정사각형당 센 세포 1개 기준입니다. 일회용 계수 슬라이드는 대개 깊이 0.1 mm의 개량형 Neubauer 격자를 따르니, 확실하지 않다면 슬라이드 설명서를 확인하세요.
이미지에서 세포 세기
혈구계는 현탁액 속 세포를 셉니다. 현미경 사진이나 전체 슬라이드에서 핵이나 세포를 세려면 이미지 분석을 사용하세요. Fiji의 Analyze Particles, QuPath, CellProfiler, 또는 SlideScope를 쓸 수 있으며, SlideScope는 코드 없이 내 컴퓨터에서 핵과 세포를 계수하고 이미지의 교정 정보로 mm²당 밀도를 보고합니다. 현미경 이미지에서 세포를 세는 방법을 참고하세요.
질문
혈구계로 mL당 세포 수는 어떻게 계산하나요?
정사각형당 계수값을 평균하고, 정사각형 하나의 부피(면적 × 깊이, Neubauer 큰 정사각형은 1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 10⁻⁴ mL)로 나눈 다음 희석 배수를 곱합니다. Neubauer 큰 정사각형이라면 정사각형당 평균 × 10⁴ × 희석 배수입니다.
트리판 블루를 쓸 때 희석 배수는 얼마인가요?
세포 현탁액과 트리판 블루를 같은 부피로 섞으면(예: 10 µL + 10 µL) 농도가 절반이 되므로 희석 배수는 2입니다. 세포 1 대 염료 4로 섞으면 배수는 5입니다.
세포 생존율은 어떻게 계산하나요?
생존율(%) = 생세포 ÷ (생세포 + 사세포) × 100. 트리판 블루를 쓰면 생세포는 투명하게 남고 사세포는 파랗게 염색됩니다.
정사각형을 몇 개 세야 하나요?
세포가 최소 100개, 가능하면 200~400개가 되도록 충분히 세세요. 오차는 약 1/√N입니다. 대부분의 배양에는 모서리의 큰 정사각형 4개로 충분하며, 세포가 드문 시료는 9개 모두 또는 두 챔버를 모두 세야 합니다.
왜 10,000을 곱하나요?
Neubauer 계수판의 큰 정사각형 하나는 0.1 µL(1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 0.1 mm³)를 담습니다. 1 mL에는 이 부피가 10,000개 들어가므로, 정사각형당 세포 수 × 10,000 = mL당 세포 수입니다.
이 계산기는 무료인가요?
네. 브라우저에서 실행되며 어디에도 데이터를 보내지 않습니다. 같은 팀이 만든 데스크톱 현미경 앱 SlideScope는 무료 샘플 라이브러리(모든 도구 포함)가 있는 유료 앱이며, 내 이미지를 열려면 구독이 필요합니다.
출처
결과는 이론값 또는 산술 계산값입니다. 임상 또는 규제 대상 업무에 사용하기 전에 장비 문서와 대조해 확인하세요.
실제 이미지에서 측정하기
SlideScope는 CZI, ND2, SVS, LIF를 포함한 34가지 현미경 및 슬라이드 스캐너 형식을 각 파일의 교정 정보와 함께 열기 때문에, 별도 설정 없이 길이, 면적, 세포 수, 스케일 바가 µm 단위로 나옵니다. 내장 샘플에서 모든 도구를 무료로 사용해 보세요. 내 이미지를 열려면 구독이 필요합니다. 이미 결정하셨나요? 지금 구독하기.