Подсчёт клеток
Калькулятор для гемоцитометра
Введите, сколько клеток вы насчитали в камере, и получите концентрацию клеток, жизнеспособность, общее число клеток и объём суспензии, который нужно взять. Калькулятор подходит для сеток улучшенной камеры Нейбауэра, Бюркера и Фукса — Розенталя, для любых подсчитанных квадратов и любого разведения, включая обычное смешивание 1:1 с трипановым синим.
Как работает формула гемоцитометра
Каждый квадрат счётной сетки вмещает известный объём: его площадь, умноженную на глубину камеры. В улучшенной камере Нейбауэра большой квадрат имеет размер 1 мм × 1 мм, а глубина камеры — 0,1 мм, поэтому большой квадрат вмещает 0,1 мм³, то есть 0,1 мкл или 10⁻⁴ мл. Разделив среднее число клеток на квадрат на этот объём, получаем клеток на мл; умножение на разведение компенсирует добавленный краситель или буфер.
клеток/мл = (N ÷ квадратов) ÷ (площадь мм² × глубина мм) × 1000 × разведение
Разобранный пример: 200 живых клеток в 4 угловых квадратах, смешивание 1:1 с трипановым синим. 200 ÷ 4 = 50 клеток на квадрат; 50 × 10⁴ × 2 = 1,0 × 10⁶ живых клеток/мл. Если вдобавок насчитано 10 мёртвых клеток, жизнеспособность равна 200 ÷ 210 = 95,2 %. Чтобы посеять 500 000 клеток, возьмите 500 000 ÷ 1 000 000 = 0,5 мл.
Правила подсчёта, которые сохраняют точность результата
- Правило границ: считайте клетки, касающиеся верхней и левой линий квадрата, и пропускайте касающиеся нижней и правой, чтобы ни одна клетка не была подсчитана дважды.
- Подсчитывайте достаточно клеток: погрешность подсчёта подчиняется распределению Пуассона и составляет около 1/√N. 100 клеток дают примерно ±10 %, 400 клеток — около ±5 %. При низкой плотности подсчитывайте больше квадратов или обе камеры.
- Разводите густые образцы: если в большом квадрате больше примерно 100 клеток, они перекрываются и часть пропускается. Разведите образец, подсчитайте заново и введите новый коэффициент разведения.
- Трипановый синий: смешивание 1:1 с 0,4 % трипановым синим даёт коэффициент разведения 2. Подсчитывайте в течение нескольких минут: живые клетки начинают поглощать краситель, и чем дольше они стоят, тем ниже жизнеспособность.
- Перемешивайте перед заполнением: клетки оседают в пробирке за считанные секунды; несколько раз наберите и выпустите суспензию пипеткой, затем заполните камеру одним плавным движением, не переполняя её.
Какой квадрат вы подсчитали?
| Камера и квадрат | Площадь | Глубина | Объём квадрата | Множитель (× число на квадрат) |
|---|---|---|---|---|
| Улучшенная камера Нейбауэра или камера Бюркера, большой квадрат | 1 мм² | 0.1 mm | 0,1 мкл | 10⁴ |
| Улучшенная камера Нейбауэра, один из 25 центральных квадратов | 0,04 мм² | 0.1 mm | 4 нл | 2.5 × 10⁵ |
| Улучшенная камера Нейбауэра, наименьший квадрат | 0,0025 мм² | 0.1 mm | 0,25 нл | 4 × 10⁶ |
| Фукс — Розенталь, квадрат 1 мм | 1 мм² | 0.2 mm | 0,2 мкл | 5 × 10³ |
Множитель применяется к числу клеток на один квадрат, до учёта разведения. Одноразовые счётные слайды обычно повторяют сетку улучшенной камеры Нейбауэра с глубиной 0,1 мм; если сомневаетесь, проверьте вкладыш к слайдам.
Подсчёт клеток на изображениях
Гемоцитометр подсчитывает клетки в суспензии. Чтобы подсчитать ядра или клетки на микрофотографии или полнослайдовом изображении, используйте анализ изображений: Analyze Particles в Fiji, QuPath, CellProfiler или SlideScope, который подсчитывает ядра и клетки на вашем компьютере без программирования и сообщает плотность на мм² по калибровке изображения. См. как подсчитать клетки на микроскопических изображениях.
Вопросы
Как рассчитать число клеток на мл по гемоцитометру?
Усредните число клеток на квадрат, разделите на объём одного квадрата (площадь × глубина; для большого квадрата Нейбауэра 1 мм × 1 мм × 0,1 мм = 10⁻⁴ мл) и умножьте на коэффициент разведения. Для больших квадратов Нейбауэра это среднее на квадрат × 10⁴ × разведение.
Каков коэффициент разведения с трипановым синим?
Смешивание равных объёмов клеточной суспензии и трипанового синего (например, 10 мкл + 10 мкл) вдвое снижает концентрацию, поэтому коэффициент разведения равен 2. Смесь 1 части клеток с 4 частями красителя даёт коэффициент 5.
Как рассчитать жизнеспособность клеток?
Жизнеспособность (%) = живые клетки ÷ (живые + мёртвые клетки) × 100. С трипановым синим живые клетки остаются прозрачными, а мёртвые окрашиваются в синий.
Сколько квадратов подсчитывать?
Подсчитайте столько квадратов, чтобы набралось не меньше 100 клеток, а в идеале от 200 до 400; погрешность составляет около 1/√N. Для большинства культур достаточно четырёх угловых больших квадратов; для разреженных образцов нужны все девять или обе камеры.
Почему умножают на 10 000?
Один большой квадрат камеры Нейбауэра вмещает 0,1 мкл (1 мм × 1 мм × 0,1 мм = 0,1 мм³). В 1 мл помещается 10 000 таких объёмов, поэтому клеток на квадрат × 10 000 = клеток на мл.
Этот калькулятор бесплатный?
Да. Он работает в вашем браузере и никуда ничего не отправляет. SlideScope — настольное приложение для микроскопии от той же команды — платное, с бесплатной библиотекой образцов (все инструменты) и подпиской для ваших собственных изображений.
Источники
Результаты носят теоретический или арифметический характер; прежде чем полагаться на них в клинической или регулируемой работе, сверьте их с документацией вашего прибора.
Измеряйте на своих реальных изображениях
SlideScope открывает 34 формата микроскопов и сканеров слайдов, в том числе CZI, ND2, SVS и LIF, с их собственной калибровкой, поэтому длины, площади, подсчёт клеток и масштабные линейки получаются в µm без какой-либо настройки. Попробуйте все инструменты бесплатно на встроенных образцах; чтобы открывать собственные изображения, нужна подписка. Уже решили? Оформите подписку.