Recuento de células
Calculadora de hemocitómetro
Introduce lo que has contado en la cámara y obtén la concentración celular, la viabilidad, el número total de células y cuánta suspensión tomar. Funciona con las cuadrículas de Neubauer mejorada, Bürker y Fuchs-Rosenthal, con cualquier cuadrado que hayas contado y con cualquier dilución, incluida la habitual mezcla 1:1 con azul de tripano.
Cómo funciona la fórmula del hemocitómetro
Cada cuadrado de la cuadrícula de recuento contiene un volumen conocido: su área por la profundidad de la cámara. En una cámara de Neubauer mejorada, un cuadrado grande mide 1 mm × 1 mm y la cámara tiene 0,1 mm de profundidad, así que un cuadrado grande contiene 0,1 mm³, es decir, 0,1 µL o 10⁻⁴ mL. Al dividir el recuento medio por cuadrado entre ese volumen se obtienen las células por mL; al multiplicar por la dilución se compensa el colorante o el tampón que añadiste.
células/mL = (N ÷ cuadrados) ÷ (área mm² × profundidad mm) × 1000 × dilución
Ejemplo resuelto: 200 células vivas en los 4 cuadrados de las esquinas, mezcladas 1:1 con azul de tripano. 200 ÷ 4 = 50 células por cuadrado; 50 × 10⁴ × 2 = 1,0 × 10⁶ células vivas/mL. Si además hay 10 células muertas, la viabilidad es 200 ÷ 210 = 95,2 %. Para sembrar 500 000 células, toma 500 000 ÷ 1 000 000 = 0,5 mL.
Reglas de recuento para que el número sea fiable
- Regla de los bordes: cuenta las células que tocan las líneas superior e izquierda de un cuadrado y omite las que tocan la inferior y la derecha, para que ninguna célula se cuente dos veces.
- Cuenta suficientes células: el error de recuento es de Poisson, aproximadamente 1/√N. Con 100 células es de alrededor de ±10 %, y con 400 células, de unos ±5 %. Cuenta más cuadrados, o ambas cámaras, cuando la densidad sea baja.
- Diluye las muestras muy concentradas: si un cuadrado grande contiene más de unas 100 células, las células se solapan y algunas no se cuentan. Diluye, vuelve a contar e introduce el nuevo factor de dilución.
- Azul de tripano: una mezcla 1:1 con azul de tripano al 0,4 % es un factor de dilución de 2. Cuenta en pocos minutos, porque las células vivas empiezan a captar el colorante y la viabilidad baja cuanto más tiempo pasan en él.
- Mezcla antes de cargar: las células sedimentan en el tubo en cuestión de segundos; pipetea arriba y abajo y luego llena la cámara de un solo trazo suave, sin rebosarla.
¿Qué cuadrado has contado?
| Cámara y cuadrado | Área | Profundidad | Volumen por cuadrado | Factor (× recuento por cuadrado) |
|---|---|---|---|---|
| Neubauer mejorada o Bürker, cuadrado grande | 1 mm² | 0.1 mm | 0,1 µL | 10⁴ |
| Neubauer mejorada, uno de los 25 cuadrados centrales | 0,04 mm² | 0.1 mm | 4 nL | 2.5 × 10⁵ |
| Neubauer mejorada, cuadrado más pequeño | 0,0025 mm² | 0.1 mm | 0,25 nL | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthal, cuadrado de 1 mm | 1 mm² | 0.2 mm | 0,2 µL | 5 × 10³ |
El factor se aplica a cada célula contada por cuadrado, antes de la dilución. Los portaobjetos de recuento desechables suelen copiar la cuadrícula de Neubauer mejorada con 0,1 mm de profundidad; en caso de duda, consulta el prospecto del portaobjetos.
Contar células en imágenes
Un hemocitómetro cuenta células en suspensión. Para contar núcleos o células en una micrografía o en un portaobjetos completo, usa el análisis de imagen: Analyze Particles de Fiji, QuPath, CellProfiler o SlideScope, que cuenta núcleos y células en tu propio ordenador sin código e indica la densidad por mm² a partir de la calibración de la imagen. Consulta cómo contar células en imágenes de microscopía.
Preguntas
¿Cómo se calculan las células por mL con un hemocitómetro?
Calcula la media del recuento por cuadrado, divídela entre el volumen de un cuadrado (área × profundidad; para un cuadrado grande de Neubauer, 1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 10⁻⁴ mL) y multiplica por el factor de dilución. Para los cuadrados grandes de Neubauer, eso es media por cuadrado × 10⁴ × dilución.
¿Cuál es el factor de dilución con azul de tripano?
Mezclar volúmenes iguales de suspensión celular y azul de tripano (por ejemplo, 10 µL + 10 µL) reduce la concentración a la mitad, así que el factor de dilución es 2. Una mezcla de 1 parte de células por 4 partes de colorante es un factor de 5.
¿Cómo se calcula la viabilidad celular?
Viabilidad (%) = células vivas ÷ (células vivas + muertas) × 100. Con azul de tripano, las células vivas quedan transparentes y las muertas se tiñen de azul.
¿Cuántos cuadrados debo contar?
Cuenta suficientes cuadrados para llegar al menos a 100 células, idealmente de 200 a 400; el error es de aproximadamente 1/√N. Para la mayoría de los cultivos bastan los cuatro cuadrados grandes de las esquinas; las muestras poco densas necesitan los nueve o ambas cámaras.
¿Por qué se multiplica por 10 000?
Un cuadrado grande de una cámara de Neubauer contiene 0,1 µL (1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 0,1 mm³). En 1 mL caben 10 000 de esos volúmenes, así que células por cuadrado × 10 000 = células por mL.
¿Esta calculadora es gratuita?
Sí. Funciona en tu navegador y no envía nada a ninguna parte. SlideScope, la aplicación de microscopía de escritorio creada por el mismo equipo, es una aplicación de pago con una biblioteca de muestras gratuita (todas las herramientas) y una suscripción para tus propias imágenes.
Fuentes
Los resultados son teóricos o aritméticos; compruébalos con la documentación de tu instrumento antes de basarte en ellos para trabajo clínico o regulado.
Mide en tus imágenes reales
SlideScope abre 34 formatos de microscopio y de escáner de portaobjetos, entre ellos CZI, ND2, SVS y LIF, con su propia calibración, así que las longitudes, áreas, recuentos de células y barras de escala salen en µm sin configurar nada. Prueba gratis todas las herramientas con las muestras integradas; para abrir tus propias imágenes necesitas una suscripción. ¿Ya lo tienes claro? Suscríbete ahora.