Počítání buněk
Kalkulačka pro hemocytometr
Zadejte, co jste v komůrce napočítali, a získáte koncentraci buněk, viabilitu, celkový počet buněk a objem suspenze, který máte odebrat. Funguje pro mřížky zlepšené Neubauerovy, Bürkerovy a Fuchs-Rosenthalovy komůrky, pro jakékoli počítané čtverce a pro jakékoli ředění, včetně obvyklého smíchání s trypanovou modří 1:1.
Jak funguje vzorec pro hemocytometr
Každý čtverec počítací mřížky odpovídá známému objemu: jeho ploše vynásobené hloubkou komůrky. Ve zlepšené Neubauerově komůrce má velký čtverec 1 mm × 1 mm a komůrka je hluboká 0,1 mm, takže velký čtverec pojme 0,1 mm³, tedy 0,1 µl neboli 10⁻⁴ ml. Vydělením průměrného počtu na čtverec tímto objemem získáte buňky na ml; vynásobením ředěním vyrovnáte přidané barvivo nebo pufr.
buňky/ml = (N ÷ počet čtverců) ÷ (plocha mm² × hloubka mm) × 1000 × ředění
Řešený příklad: 200 živých buněk ve 4 rohových čtvercích, smícháno 1:1 s trypanovou modří. 200 ÷ 4 = 50 buněk na čtverec; 50 × 10⁴ × 2 = 1,0 × 10⁶ živých buněk/ml. Pokud napočítáte i 10 mrtvých buněk, viabilita je 200 ÷ 210 = 95,2 %. Pro výsev 500 000 buněk odeberte 500 000 ÷ 1 000 000 = 0,5 ml.
Pravidla počítání, díky nimž je číslo spolehlivé
- Pravidlo okrajů: počítejte buňky dotýkající se horní a levé čáry čtverce a vynechte ty, které se dotýkají dolní a pravé, aby žádná buňka nebyla započítána dvakrát.
- Napočítejte dost buněk: chyba počítání se řídí Poissonovým rozdělením, přibližně 1/√N. 100 buněk dává zhruba ±10 %, 400 buněk asi ±5 %. Při nízké hustotě počítejte více čtverců nebo obě komůrky.
- Husté vzorky řeďte: pokud je ve velkém čtverci více než asi 100 buněk, buňky se překrývají a některé přehlédnete. Vzorek nařeďte, spočítejte znovu a zadejte nový faktor ředění.
- Trypanová modř: smíchání 1:1 s 0,4% trypanovou modří odpovídá faktoru ředění 2. Počítejte během několika minut, protože živé buňky začnou barvivo přijímat a viabilita klesá, čím déle vzorek stojí.
- Před naplněním promíchejte: buňky se ve zkumavce usadí během několika sekund; několikrát natáhněte a vypusťte pipetou a pak komůrku naplňte jedním plynulým pohybem, aniž byste ji přeplnili.
Který čtverec jste počítali?
| Komůrka a čtverec | Plocha | Hloubka | Objem na čtverec | Faktor (× počet na čtverec) |
|---|---|---|---|---|
| Zlepšená Neubauerova nebo Bürkerova komůrka, velký čtverec | 1 mm² | 0.1 mm | 0,1 µl | 10⁴ |
| Zlepšená Neubauerova komůrka, jeden z 25 středových čtverců | 0,04 mm² | 0.1 mm | 4 nl | 2.5 × 10⁵ |
| Zlepšená Neubauerova komůrka, nejmenší čtverec | 0,0025 mm² | 0.1 mm | 0,25 nl | 4 × 10⁶ |
| Fuchs-Rosenthalova komůrka, čtverec 1 mm | 1 mm² | 0.2 mm | 0,2 µl | 5 × 10³ |
Faktor platí pro jednu napočítanou buňku na čtverec, před započtením ředění. Jednorázová počítací sklíčka obvykle kopírují mřížku zlepšené Neubauerovy komůrky s hloubkou 0,1 mm; v případě pochybností se podívejte do příbalového letáku.
Počítání buněk ve snímcích
Hemocytometr počítá buňky v suspenzi. Chcete-li počítat jádra nebo buňky v mikrofotografii nebo celoplošném snímku, použijte obrazovou analýzu: Analyze Particles ve Fiji, QuPath, CellProfiler nebo SlideScope, který počítá jádra a buňky ve vašem počítači bez kódu a z kalibrace snímku udává hustotu na mm². Viz jak počítat buňky v mikroskopických snímcích.
Otázky
Jak z hemocytometru vypočítat počet buněk na ml?
Zprůměrujte počet na čtverec, vydělte ho objemem jednoho čtverce (plocha × hloubka, u velkého čtverce Neubauerovy komůrky 1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 10⁻⁴ ml) a vynásobte faktorem ředění. U velkých čtverců Neubauerovy komůrky to je průměr na čtverec × 10⁴ × ředění.
Jaký je faktor ředění s trypanovou modří?
Smícháním stejných objemů buněčné suspenze a trypanové modři (například 10 µl + 10 µl) se koncentrace sníží na polovinu, takže faktor ředění je 2. Směs 1 dílu buněk a 4 dílů barviva odpovídá faktoru 5.
Jak vypočítat viabilitu buněk?
Viabilita (%) = živé buňky ÷ (živé + mrtvé buňky) × 100. S trypanovou modří zůstávají živé buňky čiré a mrtvé se barví modře.
Kolik čtverců mám počítat?
Počítejte tolik čtverců, abyste dosáhli alespoň 100 buněk, ideálně 200 až 400; chyba je přibližně 1/√N. U většiny kultur stačí čtyři rohové velké čtverce; řídké vzorky vyžadují všech devět nebo obě komůrky.
Proč násobit 10 000?
Jeden velký čtverec Neubauerovy komůrky pojme 0,1 µl (1 mm × 1 mm × 0,1 mm = 0,1 mm³). V 1 ml je 10 000 takových objemů, takže buňky na čtverec × 10 000 = buňky na ml.
Je tato kalkulačka zdarma?
Ano. Běží ve vašem prohlížeči a nikam nic neposílá. SlideScope, desktopová aplikace pro mikroskopii od stejného týmu, je placená aplikace s bezplatnou knihovnou ukázek (všechny nástroje) a předplatným pro vlastní snímky.
Zdroje
Výsledky jsou teoretické nebo aritmetické; než se na ně budete spoléhat při klinické nebo regulované práci, ověřte je podle dokumentace svého přístroje.
Měřte na svých skutečných snímcích
SlideScope otevře 34 formátů mikroskopů a skenerů preparátů, mimo jiné CZI, ND2, SVS a LIF, s jejich vlastní kalibrací, takže délky, plochy, počty buněk i měřítka vycházejí v µm bez jakéhokoli nastavování. Vyzkoušejte všechny nástroje zdarma na vestavěných ukázkách; pro otevírání vlastních snímků potřebujete předplatné. Už máte jasno? Předplaťte si ho.