كيفية القياس الكمي لصبغة IHC

قرّر ماذا تقيس

اختر المقياس قبل أن تنظر إلى النتائج، واستخدم المقياس نفسه لكل عينة. وللمؤشرات القائمة على العدّ، تبيّن حاسبة مؤشر Ki-67 إلى أي حد قد يخطئ عدٌّ بحجم معين.

برامج القياس الكمي لـ IHC

تجد مقارنة أوسع لأدوات التحليل في مقارنة برامج تحليل صور المجهر.

كيفية القياس الكمي لـ IHC في QuPath

1. افتح الشريحة واضبط نوع الصورة على Brightfield (H-DAB)، حتى يفصل QuPath الهيماتوكسيلين عن DAB.
2. ارسم تعليقًا توضيحيًا (annotation) حول النسيج المراد تقييمه. تجنّب تقييم الصورة كاملة: فالطيات والحواف والخلفية تحرف النتيجة.
3. شغّل Analyze › Cell detection › Positive cell detection على التعليق التوضيحي. تحقّق من أن الأنوية المكتشفة تطابق الصورة، واضبط إعدادات الكشف إذا اندمجت أنوية أو فاتت.
4. لواسم نووي، اضبط Score compartment على Nucleus: DAB OD mean. تقسم عتبة واحدة الخلايا إلى إيجابية وسلبية؛ وتصنّفها حتى ثلاث عتبات إلى ضعيفة ومتوسطة وقوية (1+ و2+ و3+).
5. اقرأ Positive % للتعليق التوضيحي في تبويب Annotations. ومع ثلاث عتبات يحسب QuPath أيضًا H-score، من 0 إلى 300.
6. افتح Measure › Show annotation measurements، وصدّر الجدول إلى CSV لتحليلك الإحصائي، وسجّل العتبات في قسم الطرق.

يمكن تغيير عتبات الشدة نفسها لاحقًا عبر Classify › Object classification › Set cell intensity classifications، دون كشف الخلايا من جديد.

كيفية القياس الكمي لصبغة DAB في Fiji (ImageJ)

1. افتح صورة RGB في الحقل الساطع. الشريحة الكاملة عادةً أكبر من أن تُفتح بدقتها الكاملة، لذا صدّر منها منطقة أو حقلًا أولًا.
2. شغّل Image › Color › Colour Deconvolution واختر متجهات H DAB. تحصل على ثلاث صور: الهيماتوكسيلين، وDAB، وصورة متبقية.
3. للمساحة المصبوغة: على صورة DAB حدّد عتبة عبر Image › Adjust › Threshold، وفعّل Area fraction وLimit to threshold في Analyze › Set Measurements، ثم Analyze › Measure.
4. لنسبة الخلايا الإيجابية: عُدّ الأنوية على صورتي الهيماتوكسيلين وDAB (العتبة، وProcess › Binary › Watershed، وAnalyze › Analyze Particles)، ثم اقسم الأنوية الإيجابية على جميع الأنوية.
5. استخدم قيم العتبة نفسها لكل صورة، وسجّل الخطوات كماكرو لتكون الدفعة قابلة للتكرار.

يحذّر مؤلف الإضافة من قراءة دكانة DAB على أنها كمية من المستضد: فصبغة DAB لا تتبع قانون Beer-Lambert، والتلوين المناعي ليس متكافئًا (stoichiometric). قارن الشدة داخل دفعة صبغ واحدة فقط، وفضّل عدّ الخلايا الإيجابية أو قياس المساحة على مقارنة الدكانة الخام.

كيفية تقييم IHC في SlideScope (دون شيفرة)

1. افتح الشريحة في SlideScope على Windows أو Mac (SVS وNDPI وMRXS وCZI وTIFF وغيرها من الصيغ التي يقرؤها)، وارسم المنطقة المراد تقييمها أو قرّب إليها.
2. افتح Quantify، واضبط Objects على الأنوية وStains على Hematoxylin + DAB (IHC). إذا اختلفت ألوان صبغتك عن الإعدادات الافتراضية، فقدّر متجهات الصبغ من الشريحة.
3. في Marker classification، فعّل Classify marker-positive objects مع DAB واسمًا إيجابيًا. تبدأ عتبات الدرجات الثلاث (1+ و2+ و3+، بالكثافة الضوئية) عند 0.2 و0.4 و0.6 ويمكن تعديلها.
4. شغّله. تُرسم حدود كل نواة على الصورة، فتستطيع التحقق من النتيجة، وتصحيح فئة نواة، أو استبعاد أي شيء قُرئ خطأً.
5. اقرأ النسبة الإيجابية وH-score ودرجة Allred والخلايا الإيجابية لكل mm² للمنطقة، ثم صدّر جدول الأجسام (CSV)، والحدود (GeoJSON، الذي يفتحه QuPath)، وملخصًا للطرق.

أو اكتب السؤال. مع Ask Your Slide يمكنك أن تسأل “ما نسبة الأنوية الإيجابية لـ Ki67 في هذه المنطقة؟” أو “أعطني H-score ودرجة Allred للمنطقة التي حدّدتها”، فيشغّل SlideScope هذه الأدوات نفسها على حاسوبك ويعرض الأدلة وراء كل رقم. تستخدم الدرجات التعريفات نفسها المستخدمة في QuPath، لذا يتفق الاثنان على الخلايا نفسها. يصنّف التقييم الأنوية، وهو ما يناسب الواسمات النووية؛ والنتائج للاستخدام البحثي وتحتاج إلى تحققك البصري. المزيد في صفحة العدّ.

ما الذي يحدد صحة الرقم

• موضع الواسم: يناسب التقييم القائم على الأنوية الواسمات النووية مثل Ki-67 وER وPR وp53. أما الواسمات الغشائية (HER2 وPD-L1) والسيتوبلازمية فتحتاج إلى قياس الصبغة في تلك الحجيرة، ويتبع تقييمها السريري الدليل الخاص بالاختبار نفسه.
• عتبات تُحدَّد على الشواهد: ثبّت عتبة الإيجابية على نسيج شاهد من دفعة الصبغ نفسها، قبل تقييم التجربة، ولا تعدّلها أبدًا لكل شريحة على حدة.
• المنطقة: قيّم النسيج الذي يتعلق به السؤال، واستبعد النخر والطيات وصبغ الحواف والسدى ما لم يشملها البروتوكول. البؤر الساخنة والمقاطع الكاملة تعطي أرقامًا مختلفة؛ اذكر ما استخدمته.
• تحقّق من الكشف: انظر إلى الحدود. الأنوية المندمجة تخفض العدد والأنوية المنقسمة ترفعه؛ والنسيج المزدحم يحتاج إلى كاشف قائم على التعلّم العميق أو إلى إعدادات معدّلة.
• خلايا كافية، وn الصحيح: قيّم بضع مئات من الخلايا لكل عينة، وأجرِ الإحصاء على قيمة واحدة لكل حيوان أو مريض، لا على الخلايا أو الحقول.
• اذكره في التقرير: البرنامج وإصداره، ومتجهات الصبغ، والعتبات، وقاعدة اختيار المنطقة، والخلايا المعدودة، ومن تحقق من النتيجة.

أسئلة

المصادر

• توثيق QuPath: كشف الخلايا، وPositive cell detection، وScore compartment
• توثيق QuPath: تصنيف الخلايا، وعتبات الشدة، وPositive %، وH-score
• توثيق ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: متجهات H DAB، ولماذا لا تُعدّ دكانة DAB مقياسًا للمستضد
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

هذا الدليل لأغراض البحث والتعليم. وهو ليس إجراءً تشخيصيًا: التقييم لرعاية المرضى يتبع الاختبار المُصادق عليه، والإرشادات الحالية لذلك الواسم، وحكم اختصاصي علم الأمراض.