Jak kwantyfikować barwienie IHC

Zdecyduj, co mierzyć

Wybierz miarę, zanim spojrzysz na wyniki, i stosuj tę samą dla każdej próbki. W przypadku indeksu opartego na zliczeniu kalkulator indeksu Ki-67 pokazuje, o ile może się mylić zliczenie danej wielkości.

Oprogramowanie do kwantyfikacji IHC

Szersze porównanie narzędzi analitycznych znajdziesz w porównaniu oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych.

Jak kwantyfikować IHC w QuPath

1. Otwórz preparat i ustaw typ obrazu na Brightfield (H-DAB), aby QuPath oddzielił hematoksylinę od DAB.
2. Narysuj adnotację wokół tkanki do oceny. Nie oceniaj całego obrazu: fałdy, brzegi i tło zniekształcają wynik.
3. Uruchom Analyze › Cell detection › Positive cell detection na adnotacji. Sprawdź, czy wykryte jądra zgadzają się z obrazem, i dostosuj ustawienia wykrywania, jeśli jądra są połączone lub pominięte.
4. Dla markera jądrowego ustaw Score compartment na Nucleus: DAB OD mean. Jeden próg dzieli komórki na dodatnie i ujemne; do trzech progów klasyfikuje je jako słabe, umiarkowane i silne (1+, 2+, 3+).
5. Odczytaj Positive % dla adnotacji na karcie Annotations. Przy trzech progach QuPath oblicza też H-score w zakresie od 0 do 300.
6. Otwórz Measure › Show annotation measurements, wyeksportuj tabelę do CSV na potrzeby statystyki i zapisz progi w metodach.

Te same progi intensywności można później zmienić poleceniem Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, bez ponownego wykrywania komórek.

Jak kwantyfikować barwienie DAB w Fiji (ImageJ)

1. Otwórz obraz RGB w jasnym polu. Cały preparat jest zwykle zbyt duży, by otworzyć go w pełnej rozdzielczości, więc najpierw wyeksportuj z niego obszar lub pole.
2. Uruchom Image › Color › Colour Deconvolution i wybierz wektory H DAB. Otrzymasz trzy obrazy: hematoksylinę, DAB i obraz resztkowy.
3. Dla wybarwionej powierzchni: na obrazie DAB ustaw próg poleceniem Image › Adjust › Threshold, zaznacz Area fraction i Limit to threshold w Analyze › Set Measurements, a następnie uruchom Analyze › Measure.
4. Dla odsetka komórek dodatnich: policz jądra na obrazie hematoksyliny i na obrazie DAB (próg, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles), a następnie podziel liczbę jąder dodatnich przez liczbę wszystkich jąder.
5. Stosuj te same wartości progów dla każdego obrazu i nagraj kroki jako makro, aby seria była powtarzalna.

Autor wtyczki ostrzega przed odczytywaniem ciemności DAB jako ilości antygenu: DAB nie podlega prawu Lamberta-Beera, a immunobarwienie nie jest stechiometryczne. Porównuj intensywność tylko w obrębie jednej serii barwienia i zamiast porównywać surową ciemność, wybieraj zliczanie komórek dodatnich lub pomiar powierzchni.

Jak oceniać IHC w SlideScope (bez kodu)

1. Otwórz preparat w SlideScope na Windows lub Macu (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF i inne obsługiwane formaty) i narysuj obszar do oceny albo go przybliż.
2. Otwórz Quantify, ustaw Objects na jądra, a Stains na Hematoxylin + DAB (IHC). Jeśli kolory Twojego barwienia odbiegają od domyślnych, oszacuj wektory barwników na podstawie preparatu.
3. W sekcji Marker classification włącz Classify marker-positive objects z DAB jako markerem dodatnim. Trzy progi stopni (1+, 2+, 3+, w jednostkach gęstości optycznej) mają wartości początkowe 0,2; 0,4 i 0,6 i można je edytować.
4. Uruchom analizę. Każde jądro zostaje obrysowane na obrazie, więc możesz sprawdzić wynik, poprawić klasę jądra lub wykluczyć wszystko, co zostało błędnie odczytane.
5. Odczytaj odsetek dodatnich, H-score, wynik Allreda i liczbę komórek dodatnich na mm² dla obszaru, a następnie wyeksportuj tabelę obiektów (CSV), obrysy (GeoJSON, który otwiera się w QuPath) i podsumowanie metod.

Możesz też wpisać pytanie. Z Ask Your Slide możesz zapytać: „Jaki odsetek jąder w tym obszarze jest Ki67-dodatni?” albo „Podaj H-score i wynik Allreda dla obszaru obrysowanego przeze mnie”, a SlideScope uruchomi te same narzędzia na Twoim komputerze i pokaże dowody dla każdej liczby. Wyniki korzystają z tych samych definicji co QuPath, więc oba programy zgadzają się dla tych samych komórek. Ocena klasyfikuje jądra, co pasuje do markerów jądrowych; wyniki służą do zastosowań badawczych i wymagają Twojej wizualnej weryfikacji. Więcej na stronie o liczeniu.

Od czego zależy, czy liczba jest prawidłowa

• Gdzie znajduje się marker: ocena oparta na jądrach pasuje do markerów jądrowych, takich jak Ki-67, ER, PR i p53. Markery błonowe (HER2, PD-L1) i cytoplazmatyczne wymagają pomiaru barwienia w danym przedziale komórkowym, a ich ocena kliniczna odbywa się według instrukcji danego testu.
• Progi ustalone na kontrolach: ustal próg dodatniości na tkance kontrolnej z tej samej serii barwienia, zanim ocenisz eksperyment, i nigdy nie dostosowuj go do poszczególnych preparatów.
• Obszar: oceniaj tkankę, której dotyczy pytanie, i pomijaj martwicę, fałdy, barwienie brzegów i podścielisko, chyba że protokół je obejmuje. Hotspoty i całe przekroje dają różne liczby; podaj, czego użyłeś.
• Sprawdź wykrywanie: obejrzyj obrysy. Połączone jądra zaniżają liczbę, a podzielone ją zawyżają; gęsta tkanka wymaga detektora opartego na uczeniu głębokim lub dostosowanych ustawień.
• Wystarczająco dużo komórek, właściwe n: oceniaj kilkaset komórek na próbkę i prowadź statystykę na jednej wartości na zwierzę lub pacjenta, a nie na komórkach czy polach.
• Raportuj: oprogramowanie i wersję, wektory barwników, progi, regułę wyboru obszaru, liczbę zliczonych komórek i to, kto sprawdził wynik.

Pytania

Źródła

• Dokumentacja QuPath: wykrywanie komórek, Positive cell detection i Score compartment
• Dokumentacja QuPath: klasyfikacja komórek, progi intensywności, Positive % i H-score
• Dokumentacja ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: wektory H DAB i dlaczego ciemność DAB nie jest miarą antygenu
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Ten przewodnik służy badaniom naukowym i dydaktyce. Nie jest procedurą diagnostyczną: ocena na potrzeby opieki nad pacjentem odbywa się według zwalidowanego testu, aktualnych wytycznych dla danego markera i oceny patologa.